Repertoireanalyse monoklonaler Antikörper des Liquors von Patienten mit anti- NMDA-Rezeptor-Enzephalitis

Abstract

Die Anti-N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor(NMDAR)-Enzephalitis ist die häufigste Form autoimmun vermittelter Hirnentzündungen. Die PatientInnen entwickeln typischerweise zunächst psychotische Veränderungen wie inhaltliche Denkstörungen und Halluzinationen und in der Folge neurologische Symptome, wie Bewusstseinsstörungen, Dyskinesien, epileptische Anfälle, autonome Dysregulationen und zentrale Hypoventilation. Der Nachweis von Antikörpern gegen die NR1-Untereinheit des NMDAR im Liquor gilt als wichtigstes Diagnosekriterium. Bisherige Arbeiten mit extrahiertem Gesamt-Immunglobulin aus Liquor und Serum von PatientInnen zeigten Störungen der synaptischen Funktion in vitro und in vivo. Der Einfluss weiterer möglicher Autoantikörper konnte dabei nicht ausgeschlossen werden und der Beweis für die Pathogenität NR1-spezifischer Antikörper war bisher ausstehend. Dazu generierten wir monoklonale rekombinante humane Antikörper aus Liquorproben von acht Patientinnen mit NMDAR-Enzephalitis. Wir isolierten einzelne Gedächtnis-B-Zellen sowie Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie. Die variablen Regionen der für die schweren und leichten Immunglobulinketten kodierenden Genabschnitte amplifizierten mittels Polymerase-Kettenreaktion. Diese klonierten wir in Vektoren, die den konstanten Genabschnitt humaner Antikörper enthalten. Mit dem jeweiligen Vektorenpaar aus schwerer und leichter Immunglobulinkette co-transfizierten wir menschliche embryonale Nierenzellen (HEK-Zellen) und gewannen aus dem Kulturmedium die monoklonalen Antikörper. Sechs Prozent der generierten rekombinanten humanen Antikörper zeigten eine Reaktivität auf NR1-transfizierten HEK-Zellen, ebenso das für NR1-spezifische Antikörper typische Färbemuster auf hippocampalen Neuronen und auf Mäusehirnschnitten. Alle NR1-spezifischen Antikörper waren vom IgG-Isotyp, sie ließen sich aus Plasmazellen sowie Gedächtnis-B-Zellen isolieren. Letztere könnten als Ausgangspunkt möglicher späterer Rezidive klinisch relevant sein. Einige der NR1-spezifischen Antikörper zeigten eine klonale Expansion mit 100 Prozent identischen Klonen und wiesen wenige somatische Hypermutationen auf, was auf eine kürzlich stattgefundene periphere Immunreaktion hindeutet. Wir fanden zudem drei völlig unmutierte NR1-spezifische Antikörper („naturally occuring antibodies“), was bei diesen Patientinnen eine unvollständige Immuntoleranz gegenüber NR1 nahelegt. Auf hippocampalen Neuronen führte die Inkubation mit monoklonalen NR1-spezifischen Antikörpern zu einer Senkung der NMDAR-Dichte sowie zu einer Reduktion der NMDAR-spezifischen Ströme. Nach intravenösen Injektionen in Mäuse ließ sich eine Anreicherung der Antikörper im Hippocampus und Kleinhirn nachweisen. Für über 95 Prozent der nicht NR1-bindenden Antikörper zeigte sich eine spezifische Reaktivität auf Mäusehirnschnitten, unter anderem an neuronalen Oberflächen, an Gliazellen und an Endothel. Mit diesen Daten konnten wir nachweisen, dass monoklonale NR1-spezifische Antikörper allein neurotoxisch sind. Damit ist jeder Nachweis dieser Autoantikörper als ein Risikofaktor für neuropsychiatrische Symptome anzusehen. In zukünftigen Arbeiten gilt es zu klären, ob das Vorhandensein verschiedener NR1-spezifischer Antikörper prognostisch relevant ist und ob weitere Autoantikörper zur Pathophysiologie beitragen.

The anti-N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis is the most common form of autoimmune mediated brain inflammation. Typically patients initially develop psychotic changes such as substantive thought disorders and hallucinations, followed by neurological symptoms like impaired consciousness, dyskinesia, seizures, autonomic dysregulations and central hypoventilation. The detection of antibodies against the NR1 subunit of the NMDAR in the cerebrospinal fluid (CSF) is the most important diagnostic criterion. Previous works with extracted whole immunoglobulins from patients‘ CSF and serum have shown synaptic dysfunction in vitro and in vivo. Thereby an influence of further possible autoantibodies could not be eliminated and the proof of pathogenicity of NR1-specific antibodies was pending. Therefore we generated monoclonal recombinant human antibodies from CSF samples from eight patients with NMDAR encephalitis. We isolated single memory B cells and plasma cells via flow cytometry. The variable gene regions coding the heavy and light immunoglobulin chains were amplified by polymerase chain reaction. These were cloned into vectors, containing the constant gene sequence of human antibodies. We co-transfected human embryonic kidney (HEK) cells with the respective pair of heavy and light immunoglobulin chains and harvested monoclonal antibodies from the culture medium. Six percent of the generated monoclonal recombinant human antibodies showed reactivity to NR1-transfected HEK cells, likewise the typical NR1-specific staining pattern on hippocampal neurons and mouse brain sections. All NR1-specific antibodies were from the IgG isotype and have been isolated from plasma cells as well as memory B cells. Last-mentioned ones might be clinically relevant as possible origin of future relapses. Several of the NR1-specific antibodies showed clonal expansion with 100 percent identical clones and few somatic hypermutations, indicating a recent peripheral immune reaction. Furthermore we found three completely unmutated NR1-specific antibodies („naturally occurring antibodies“), suggesting incomplete immune tolerance against NR1 in these patients. Incubating hippocampal neurons with monoclonal NR1-specific antibodies caused a reduction of the NMDAR density and NMDAR-specific currents. After intravenous injections into mice, antibody enrichment in the hippocampus and cerebellum was detected. More than 95 percent of the non- NR1-binding antibodies showed specific reactivity on mouse brain sections, amongst others to neuronal surfaces, glia cells and endothelium. With these data we proved that monoclonal NR1-specific antibodies alone are neurotoxic. Therewith, any detection of these autoantibodies needs to be considered as a risk factor for neuro-psychiatric symptoms. Future work will clarify whether the presence of different NR1-specific antibodies is of prognostic relevance and whether further autoantibodies contribute to the pathophysiology.