GENTHERAPIE DURCH EINEN RGD-MOTIV MODIFIZIERTEN, HUMANEN TELOMERASE REVERSE TRANSKRIPTASE REGULIERTEN, TUMOR NEKROSE FAKTOR VERWANDTEN APOPTOSE INDUZIERENDEN LIGAND EXPRIMIERENDEN ADENOVIRALEN VEKTOR

Abstract

In dieser Studie ist ein neu konstruierter adenoviraler Vektor getestet worden, der das Tumor Nekrose Faktor-verwandten Apoptose-induzierenden Ligand (TRAIL) Gen über den schwachen tumorspezifischen humanen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) Promoter exprimiert. Dieser Promoter ist in über 85% aller humanen Karzinome aktiv bei gleichzeitiger Inaktivität in den meisten somatischen Zellen. Das Problem der niedrigen Genexpression des hTERT- Promoters ist dabei durch ein Verstärkungssystem umgangen worden. Dabei exprimiert der schwache tumorspezifische Promoter (hTERT) das GAL4/GV16 Fusionsprotein in den Tumorzellen, wodurch ein GAL4/TATA (GT) Promoter mit niedriger Basalaktivität aktiviert wird und in den Tumorzellen eine stark erhöhte Expression des TRAIL-Proteins auslöst. Aufgrund einer häufig beobachteten Resistenzbildung bei einer wiederholten Applikation des Adenovirus, die auf einer Runterregulation des initialen Coxsackie-Adenovirus- Rezeptors (CAR) beruht, ist das Virus mit einer Arginin-Glycin-Aspartat (RGD) Sequenz in der HI Schleife des Fiber-Proteins zur verbesserten Transduktion modifiziert worden. Die in vitro Testung des Ad/TRAIL-F/RGD hat dabei in Pankreas-, Hepatozellulären-, Kolon- und Lungenkarzinomzelllinien eine deutliche Proliferationshemmung (XTT-Test) und Apoptoseinduktion (Durchflusszytometrie) gegenüber den Kontrollgruppen Phosphate-Buffered Saline (PBS) und Ad/CMV-GFP. Zusätzlich hat der Vergleich mit dem nicht RGD- modifizierten Vorgängervektor Ad/gTRAIL in mehreren Tumorzelllinien eine deutlich erhöhte Proliferationshemmung bei einer niedrigen Infektionsrate von 500 Viruspartikel/Zelle gezeigt. Die weitere in vivo Testung an einem vorher etablierten orthotopen Pankreastumormodel durch dreimalige intratumorale Injektion hat zu einem signifikant reduzierten Tumorwachstum in den mit Ad/TRAIL-F/RGD behandelten Tieren gegenüber den Kontrollen geführt. Die Tumorspezifität des Vektors ist dabei durch normwertige Leberenzyme nachgewiesen worden. Zusätzlich ist in vitro eine nicht vorhandene Transduktion von mesenchymalen Stammzellen aufgezeigt worden. Zur Überprüfung einer möglichen systemischen Therapie und Steigerung der Effizienz ist eine Kombinationstherapie mit Gemcitabin als Folgeexperiment angeschlossen worden. Dabei hat sich in vitro ein starker Synergismus gezeigt. Zur weiteren Überprüfung ist ein Pankreastumormodel in der Leber etabliert und der adenovirale Vektor dreimal systemisch mit oder ohne die intraperitoneale Gabe von Gemcitabin appliziert worden. Die Auswertung der Tumorareale hat eine signifikante Tumorwachstumshemmung in den mit Ad/TRAIL-F/RGD und der Kombination aus Ad/TRAIL-F/RGD und Gemcitabin behandelten Tieren gegenüber der Kontrolle und Gemcitabin als alleiniger Therapie ergeben. Allerdings ist der Unterschied zwischen der Einzelgabe von Ad/TRAIL-F/RGD im Vergleich zu der Kombinationstherapie mit Gemcitabin zwar deutlich, aber nicht signifikant gewesen. Diese Ergebnisse haben eine signifikante Tumorwachstumshemmung durch intratumorale und systemischer Applikation des neuen adenoviralen Vektors Ad/TRAIL-F/RGD gezeigt. Es bleibt abzuwarten, ob der Einsatz in dieser Kombination mit Gemcitabin in klinischen Studien folgt, oder ob eher eine Kombination mit onkolytischen Viren erfolgsversprechender ist.

A new adenoviral vector expressing the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) gene from the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter was constructed and tested in this trial. The weak hTERT promoter is highly active in more than 85% of human cancer cells but inactive in most somatic cells. The problem of an hTERT promoter associated low gene expression was avoided by using an augmentation system. A tumorspecific but weak promoter (hTERT) expresses a GAL4/GV16 fusion protein in the cancer cells. These proteins activate a GAL4/TATA (GT) promoter with a low base activity and that promoter in turn leads in the tumor cells to a high expression of TRAIL-protein. However, repeated application of adenoviral vectors can result in the selection and expansion of resistant cells. One mechanism involved in this aquired resistance is the decreased expression of the initial binding receptor, the coxsackie-adenovirus receptor (CAR). Modifying the adenoviral vector by incorporating the integrin-binding motif RGD (arginine-glycine-aspartat sequence) into the HI loop of the fiber protein increased transduction efficiency. The new vector Ad/TRAIL-F/RGD shows in vitro a reduced cell viability (XTT-Test) and increased apoptosis induction (FACS analysis) in human pancreatic, hepatoma, colon and lung cancer cell lines in comparison to the control groups with phosphate-buffered saline (PBS) and the vector Ad/CMV-GFP. In addition, the cell killing effect of the new vector was explicitly increased compared to the non-RGD-modified vector Ad/gTRAIL in several cancer cell lines at a low concentration of 500 virus particle/cell. In vivo study showed that triple administration into the tumor of Ad/TRAIL-F/RGD s in a previously established orthotopic pancreatic tumor model significantly suppressed tumor growth. The tumor specifity and non- toxicity of the vector was proven by evaluating liver enzymes before and after the treatment, which were all within the normal ranges. Moreover, no adverse effect was observed in mesenchymal stem cells treated with Ad/TRAIL-F/RGD in vitro. To evaluate the possibility of systemic virus administration and augmentation of the therapeutic effect, a combination therapy with gemcitabine was performed. The administration with gemcitabine and Ad/TRAIL-F/RGD had a synergistic effect on the induction of apoptosis in human pancreatic cancer cell lines. Systemic administration of gemcitabine intraperitoneal and Ad/TRAIL-F/RGD via tail veins suppressed the growth in an established pancreatic tumor model in the liver more than single treatment. Analysis of the tumor area showed a significant reduced tumor growth in animals treated with Ad/TRAIL-F/RGD alone or in combination with gemcitabine compared to the control group or single gemcitabine injection. Non the less, there was no significant difference in vivo between animals treated with Ad/TRAIL-F/RGD alone or in combination with gemcitabine. These results showed a significant reduced tumor growth by intratumoral and systemic application of the new adenoviral vector Ad/TRAIL-F/RGD. It remains to be seen, if an application of the combination therapy of Ad/TRAIL-F/RGD with gemcitabine is following in clinical studies or the therapeutic approach with oncolytic viruses is more promissing.