Identifizierung und Charakterisierung niedermolekularer Verbindungen zur Hemmung der Umverteilung von Aquaporin-2 in renalen Hauptzellen

Abstract

Die Wasserrückresorption in Hauptzellen des renalen Sammelrohrs wird vom Peptidhormon Arginin-Vasopressin (AVP) reguliert. AVP bindet an Vasopressin-V2-Rezeptoren auf der basolateralen Seite der Hauptzellen. Dies führt zum Anstieg intrazellulärer cAMP-Spiegel und der Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Aquaporin-2-(AQP2)-Wasserkanäle werden von PKA am C-terminalen Serin-Rest S256 phosphoryliert und translozieren dann von intrazellulären Vesikeln in die luminale Plasmamembran. Es kommt zur Rückresorption von Wasser aus dem Primärharn. In dieser Arbeit wird die erfolgreiche Etablierung eines neuen zellbasierten Hochdurchsatzverfahrens um neue Proteinen zu entdecken, die die Lokalisation von AQP2 kontrollieren, gezeigt. Als Modellsystem dienten Sammelrohrzellen der Maus, die stabil humanes AQP2 exprimieren (MCD4-Zellen). Diese Methode identifizierte 4-Acetyldiphyllin (4AD) als Inhibitor der cAMP-abhängigen AQP2-Umverteilung in die Plasmamembran von MCD4- und primären innermedullären Sammelrohrzellen (IMCD-Zellen). Von 4AD ist bekannt, dass die Verbindung vakuoläre H+-ATPasen (V-ATPasen) inhibiert. 4AD verhinderte die cAMP-abhängige Zunahme der AQP2-Phosphorylierung an S256 in IMCD-Zellen ohne die cAMP-Synthese durch Adenylylcyclasen oder die Aktivität der PKA zu beeinflussen. Die Behandlung von MCD4-Zellen mit 4AD führte zum Anstieg der pH-Werte intrazellulärer Vesikel und der Akkumulation von AQP2 im Golgi-Apparat. Es kann daher die Notwendigkeit niedriger/azidischer intravesikulärer pH-Werte für die cAMP- abhängige Phosphorylierung von AQP2 durch PKA für die AQP2-Umverteilung in renalen Hauptzellen und den Transport von AQP2-haltigen Vesikeln aus dem Golgi-Apparat festgestellt werden. 4AD kann als molekulares Werkzeug zur Untersuchung von intrazellulären Proteintransportprozessen dienen und helfen Einsichten in die räumlichen und zeitlichen Abläufe der AQP2-Phosphorylierung an S256 zu gewinnen. Die mögliche Anwendung von 4AD bei Erkrankungen, die mit exzessiver Wasserretention, wie bei chronischer Herzinsuffizienz oder dem Schwarz-Bartter-Syndrom, assoziiert sind, muss zukünftig eingehend untersucht und bewertet werden. Ein Triazolpropenon (TP) ist ebenfalls im genannten Hochdurchsatzverfahren als Hemmer der cAMP-abhängigen AQP2-Umverteilung in MCD4- und primären IMCD-Zellen identifiziert worden. Nähere Untersuchungen offenbarten eine Überschneidung von zur Hemmung der AQP2-Translokation nötigen Konzentrationen mit den für Zellen letalen Konzentrationen von TP. Die Testung kommerziell erhältlicher und neu synthetisierter Derivate von TP zeigte, dass keine dieser Verbindungen die FSK-stimulierte Umverteilung von AQP2 in MCD4-Zellen hemmen konnte. Die Reduktion der zellulären Letalität und gleichzeitige Erhaltung einer Hemmung der AQP2-Translokation war somit mit den in dieser Arbeit untersuchten Derivaten nicht möglich. Andere Di- und Triazol- Verbindungen werden zur Anwendung als Fungizide und antimikrobielle Zubereitungen bei Pflanzen genutzt. Komplexere Azol-Verbindungen sind zur Anwendung bei Tuberkulose oder Malaria im Gespräch. Der Wirkmechanismus dieser Azole könnte die Hemmung des Sterolbiosynthese-Enzyms 14α-Demethylase sein, wie es für bereits therapeutisch genutzte Azolantimykotika bekannt ist. Fluconazol wurde als Vertreter dieser Arzneistoffklasse in MCD4-Zellen getestet, um eine mögliche Hemmung der AQP2-Umverteilung nachzuweisen. Überraschender Weise konnte Fluconazol die Forskolin-induzierte AQP2-Translokation nicht hemmen. Im Gegenteil verursachte Fluconazol in Abwesenheit von Forskolin die Anreicherung von AQP2 in der Plasmamembran. Weitere Untersuchungen müssen klären, ob die pharmakologische Inhibition der 14α-Demethylase tatsächlich zur Umverteilung von AQP2 führt oder andere Effekte dazu beitragen. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit neue niedermolekulare Verbindungen zur Hemmung der cAMP-abhängigen AQP2-Umverteilung identifiziert, die zu detaillierterem Wissen darüber, wie die AQP2-Lokalisation reguliert wird, beitragen können. Von den Erkenntnissen dieser Arbeit kann die Entwicklung neuer Therapieansätze zur Behandlung von Erkrankungen, die mit AQP2-abhängiger Wasserretention aber auch Störungen der Harnkonzentrierung assoziiert sind, beeinflusst werden.

Urinary concentrating ability of renal collecting duct principal cells is regulated by arginine-vasopressin (AVP). AVP binds to vasopressin type 2 receptors (V2R) on the surface of the cells. This leads to elevation of cAMP and subsequent activation of protein kinase A (PKA). Aquaporin-2 (AQP2) water channels are phosphorylated by PKA at serine residue 256 (S256) and translocate from intracellular vesicles into the plasma membrane, thereby facilitating water reabsorption from primary urine. Only a few proteins and stimuli are known to drive the cAMP-dependent redistribution of AQP2. This work shows the successful development of a novel cell-based high-throughput method to discover novel players involved in the control of the localization of AQP2. This approach identified the small-molecule 4-acetyldiphyllin (4AD) as an inhibitor of the cAMP-dependent AQP2 redistribution to the plasma membrane of MCD4 and primary inner medullary collecting duct (IMCD) cells. 4AD is a known inhibitor of vacuolar (V)-ATPase. 4AD prevented the cAMP-dependent increase of AQP2 phosphorylation at S256 in IMCD cells without affecting cAMP formation or PKA activity. 4AD treatment increased pH levels of intracellular vesicles and caused the accumulation of AQP2 in the Golgi compartment. Thus an acidic pH of intracellular vesicles is essential for the exit of AQP2-bearing vesicles from the Golgi and facilitates the cAMP-dependent and PKA-catalyzed phosphorylation of AQP2 at S256 and, thereby, its translocation to the plasma membrane of renal collecting duct cells. 4AD can serve as a molecular tool to study intracellular protein trafficking processes and provide insights into spatial and temporal AQP2 S256 phosphorylation dynamics. The treatment of diseases associated with excessive water retention, as chronic heart failure (CHF) or the syndrome of inappropriate ADH hypersecretion (SIADH) with 4AD has to be evaluated in the future. A triazol propenone compound (TP) was also identified as inhibitor of the cAMP-dependent AQP2 redistribution in MCD4 and primary IMCD cells. Further analysis revealed an adverse overlap of TP concentrations blocking AQP2 translocation with lethal concentrations. The investigation of commercially available and newly synthesized TP derivatives showed, that none of these compounds was able to block forskolin-induced AQP2 translocation in MCD4 cells. The reduction of lethality in concert with preserved inhibition of the AQP2 translocation was not possible. Other di- and triazole compounds had been suggested to be utilized as fungicidal and antibacterial drugs for plants, more complex compounds were also considered as medication for tuberculosis and malaria patients. An assumed though not proven mechanism of action of these compounds is the inhibition of the sterol biosynthesis enzyme 14α-demethylase. Therapeutically administered azole antimycotic drugs share this mechanism of action. Fluconazole as a member of this drug class was tested for its ability to block forskolin-induced AQP2 translocation in MCD4 cells. Surprisingly, fluconazole did not inhibit AQP2 redistribution, but induced AQP2 translocation in the absence of forskolin. Further investigations must analyze if the pharmacological inhibition of 14α- demethylase leads to AQP2 translocation or if other unrelated mechanisms promote the AQP2 redistribution into the plasma membrane. Taken together, this work identified new small-molecule compounds that will yield mechanistic insights into the molecular mechanisms underlying the AQP2 redistribution and might pave the way to the development of new therapeutic approaches to treat diseases associated with AQP2-dependent water retention.