Funktionelle Charakterisierung des C-Klasse Chemokins ATAC in vivo

Abstract

ATAC ist ein Mitglied der Chemokin-Familie, welches hauptsächlich von aktivierten CD8+ T-Zellen und NK-Zellen freigesetzt wird. Das Expressionsmuster des ATAC-Rezeptors XCR1 war jedoch umstritten, weshalb die physiologische Funktion von ATAC bislang unklar blieb. In dieser Arbeit wurde die Rolle von ATAC und XCR1 im murinen System untersucht. Um die XCR1-exprimierenden Zellen in der Milz zu definieren, wurden ruhende und aktivierte Milzzellen aus unterschiedlichen Mausstämmen isoliert und durch quantitative RT-PCR analysiert. XCR1 konnte eindeutig in CD8+ dendritischen Zellen (DZ), geringfügig in CD8- DZ, aber nicht in den anderen Zellpopulationen nachgewiesen werden. Der Einfluss von ATAC auf die antigen- spezifische Aktivierung von CD8+ T-Zellen wurde untersucht, indem WT oder ATAC KO OT-I-Zellen adoptiv transferiert und CD8+ DZ der syngenen Rezipienten über das Molekül DEC-205 selektiv mit Antigen (DEC205:OVA) beladen wurden. In diesem Modell wurde eine sehr frühe (ab 6 h) und dauerhafte (bis 48 h) ATAC- Sekretion in WT OT-I-Zellen beobachtet. In Abwesenheit des ATAC-Signals erhöhte sich die Expression von CD69 und 4-1BB auf transferierten OT-I-Zellen 18-24 h nach Stimulation, aber ein deutlicher Einfluss auf die Proliferation und Apoptose der transferierten OT-I-Zellen 2-6 Tage nach Stimulation konnte nicht festgestellt werden. Dies galt sowohl für eine Stimulation mit DEC:OVA alleine („Toleranz“) als auch für DEC:OVA plus anti-CD40-Antikörper („Entzündung“). Jedoch wiesen transferierte ATAC KO OT-I-Zellen eine deutlich verringerte Populationsgröße 12 und 40 Tage nach Stimulation mit DEC:OVA plus anti-CD40-Antikörper auf. Funktionell zeigten diese ATAC KO OT-I-Zellen eine beeinträchtige zytotoxische Aktivität an den Tagen 7 und 12. Weiterhin konnte in vivo eine chemotaktische Wirkung von ATAC nachgewiesen werden. Nach Injektion in den Peritonealraum wanderten bestimmte DZ-Subpopulationen (CD8+CD205+CD11b-CD4- DZ und CD8-CD205+CD11bniedrigCD4- DZ) ein. Bei der Untersuchung von alten ATAC KO C57BL/6 Mäusen fiel darüber hinaus auf, dass Speicheldrüse und Milz deutlich vergrößert waren, ohne dass ein Verlust von Körpergewicht und eine Schädigung der Organstruktur feststellbar waren. Dies ging mit der Aktivierung und Expansion vieler Immunzellen, insbesondere von CD4+ T-Zellen, follikulären B-Zellen und Granulozyten einher. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass ATAC die Kooperation von Antigen-erkennenden CD8+ T-Zellen mit XCR1-tragenden DZ optimiert und so die Poolgröße und zytotoxische Kapazität dieser CD8+ T-Zellen erhöht. Zusammen mit der bereits früher nachgewiesenen chemotaktischen Aktivität von ATAC auf XCR1+ DZ ergeben diese funktionellen Daten zum ersten Mal ein Konzept der physiologischen Wirkung von ATAC.

ATAC, a member of the chemokine family of molecules, is secreted mostly by activated CD8+ T cells and NK cells. Mainly due to the disputed expression pattern of its receptor XCR1, the physiological function of ATAC remained elusive to date. In this work, the role of ATAC and XCR1 was investigated in the murine system. To identify the XCR1-expressing cells, the splenic cell populations were sorted from different mouse strains and analysed in both steady and activated states through quantitative RT-PCR. The results showed that XCR1 is essentially expressed on CD8+ dendritic cells (DC) and to a small extent on CD8- DC cells, but not on other cell types. Furthermore, the influence of ATAC on the antigen-specific activation of CD8+ T cells was examined by adoptive transfer of WT or ATAC KO OT-I cells and selective application of antigen into the CD8+ DC of recipient mice with the help of an DEC-205-specific antibody coupled to the antigen ovalbumin (DEC:OVA). In this model, WT OT I T cells continued to secrete ATAC from an early time point (6 h) for up to 48 h. The absence of ATAC enhanced the expression of CD69 and 4-1BB on the transferred OT-I T cells 18-24 h after stimulation, but did not overtly influence their proliferation or apoptosis in the 2-6 days following stimulation with DEC:OVA alone (“tolerization”) or DEC:OVA plus anti-CD40 (“immunization”). However, the pool size of transferred ATAC KO OT-I cells was substantially reduced on days 12 and 40 upon application of DEC:OVA in combination with anti-CD40. Functionally, ATAC KO OT-I cells exhibited a reduced cytotoxicity on days 7 and 12 after antigen delivery. Further, a chemotactic activity of ATAC could be demonstrated in vivo: after i.p. injection of ATAC, certain DC subsets (CD8+CD205+CD11b-CD4- DC and CD8-CD205+CD11blowCD4- DC) migrated into the peritoneal cavity. The analysis of old ATAC KO C57BL/6 mice revealed enlarged salivary glands and spleens, but no reduction of body weight or any visible damage in organ structure. However, immune cell populations were substantially expanded in these mice, especially CD4+ T cells, follicular B cells, and granulocytes. In summary, we could demonstrate that ATAC optimizes the cooperation between antigen-recognizing CD8+ T cells and XCR1-expressing DC, which resulted in an increased pool size and cytotoxic capacity of these CD8+ T cells. Together with the previously observed in vitro chemotactic activity of ATAC on XCR1+ DC, this work provides for the first time a concept for the physiological function of ATAC.