Untersuchungen zur Wechselwirkung von Mikrotubuli mit Kinesinen und Colchicin- Derivaten

Abstract

Mikrotubuli sind essentiell für die Zellteilung und intrazelluläre Transportprozesse. Für Letztere stellen sie die Pfade, entlang derer Zellbestandteile zu ihrem Bestimmungsort transportieren werden. Dieser Transport wird u.a. von Kinesinen vermittelt, wobei sogenannte Motordomänen an die Mikrotubuli binden und sich unter ATP-Verbrauch fortbewegen. Kristallstrukturen existieren für Kinesin-Motordomänen und αβ-Tubulin. Komplexe beider Interaktionspartner können bis heute nicht kristallographisch untersucht werden. Kryo-Elektronenmikroskopie wird genutzt, um die an der Wechselwirkung beteiligten Sekundärstrukturelemente zu bestimmen. Die Auflösung dieser Methode ist limitiert. Zudem werden dynamische Anpassungen beobachtet, die zu Abweichungen von vorhandenen Kristallstrukturen führen. Mittels Festkörper-MAS-NMR-Spektroskopie wurde erstmals die Wechselwirkung zwischen Kinesin-Motordomänen und Mikrotubuli auf atomarer Ebene untersucht. Als notwendige Voraussetzung für NMR-Messungen wurden reproduzierbare Methoden zur Herstellung isotopenmarkierter Proteine und Proteinkomplexe etabliert. Es wurden native Mikrotubuli mit natürlicher Isotopenverteilung genutzt. Kinesin- Motordomänen wurden durch rekombinante Expression uniform 2H-13C-15N- isotopenmarkiert. Es wurden Magnetisierungstranfers von Protonen der Mikrotubuli zu 13C- und 15N-Kernspins der Kinesin-Motordomänen durchgeführt. Mit dipolaren Wiedereinkopplungssequenzen wurden selektiv interagierende Reste auf Seiten der Motordomänen gefiltert. Es wurde eine begrenzte Anzahl an Kreuzsignalen bestimmter Aminosäuretypen detektiert. Die Signale von geladenen Aminosäureresten der Kinesin-Motordomänen deuten auf eine elektrostatische Wechselwirkung mit der negativ geladenen Oberfläche der Mikrotubuli hin. In Hinblick auf sequenzielle Zuordnungen wurde die signalverstärkende Methode der dynamischen Kernpolarisation angewendet. Mit der vorgestellten Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen wurde die Grundlage für weiterführende Strukturanalysen geschaffen. Außerdem wurden neue Colchicin- Analoga auf ihre biologische Aktivität untersucht. Colchicin ist ein Naturstoff, der die Tubulin-Polymerisation und dadurch die Bildung von Mikrotubuli unterdrückt. Aufgrund seiner hohen Toxizität wird es nicht für antiproliferative Therapien eingesetzt. Folglich ist es notwendig neue Colchicinoide mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften zu entwickeln. Die hier betrachteten Colchicinoide waren zumeist in schwächerer Form in der Lage die Tubulin-Polymerisation in vitro zu hemmen und an die Colchicin- Bindestelle zu binden. Außerdem wurde von einigen Verbindungen die intrazelluläre Morphologie der Mikrotubuli beeinflusst. Die Ergebnisse waren im Einklang mit Zellkulturuntersuchungen zur Proliferations-Hemmung und Apoptose-Induktion. Insgesamt wurden zwölf potente Substanzen identifiziert, auf deren Basis rationale Diversifizierungen durchgeführt werden könnten.

Microtubules are essential in cell division and intracellular transport, as they supply paths along which cellular components are transported to their site of action. This transport is mediated e.g. by kinesins. So-called motor domains bind to microtubules and move via ATP turnover. Crystal structures exist for kinesin motor domains as well as for αβ-tubulin. Complexes of both interacting proteins have eluded a study by crystallography. Cryo-electron microscopy has been used to study the interaction of kinesins and microtubules, allowing secondary structural elements to be determined. However, the limited resolution of this method means that it is not possible to identify interacting amino acid residues. In addition, dynamic conformational changes are observed that deviate from existing crystal structures. Solid-state MAS NMR spectroscopy was applied for the first time to investigate the interaction of kinesin motor domains and microtubules at the atomic level. As a necessary prerequisite for NMR measurements, reproducible methods for preparing isotopically labelled proteins and protein complexes were established. Native microtubules were used with natural abundance isotope distributions whereas kinesin motor domains were labelled with 2H-, 13C-, 15N- isotopes by recombinant expression. Magnetisation transfer from protons in the microtubule to 13C and 15N nuclear spins in the kinesin motor domains was achieved. With dipolar recoupling sequences the interacting residues on the kinesin side were filtered selectively. It resulted in the detection of a limited number of cross peaks for certain amino acid types. In particular, signals observed from charged amino acids of the kinesin motor domain suggest an electrostatic interaction with the highly negatively charged surface of the microtubules. For sequential assignment experiments, dynamic nuclear polarization was used for signal enhancement. The proposed method for studying protein-protein interactions is fundamental for further structural analysis. In addition new colchicine analogues were investigated for their biological activity. Colchicine is a natural compound that inhibits the polymerisation of tubulin thereby preventing the formation of microtubules. Due to its high toxicity it is not used for antiproliferative therapy. Consequently, there is a need to develop colchicine derivatives with improved therapeutic properties. Most of the colchicinoids analysed in this thesis were capable of inhibiting tubulin polymerisation in vitro and bound to the colchicine-binding site on tubulin. In addition, some of the compounds could affect the intracellular morphology of the microtubules. The results were consistent with cell culture studies of proliferation inhibition and apoptosis induction. In all, twelve potent compounds were identified. On their basis rational diversification could be carried out.