dc.contributor.author
Dong, Jiaxin
dc.date.accessioned
2018-06-07T20:11:47Z
dc.date.available
2001-05-04T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6691
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10890
dc.description
Inhalt
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
I. Introduction
II. Materials and methods
III. Results and discussions
IV. Major contributions
V. Summary
VI. References
Appendix A
Publications
Acknowledgements
Curriculum vitae
dc.description.abstract
To study the impact of dynamin II, a 100 kD GTP-binding protein, and of its
individual domains on vesicle biogenesis at the TGN, the pleckstrin-homology
domain (PHD), the proline-rich domain (PRD) and the C-terminal part of dynamin
II (PCP)-comprising PHD, a coiled-coil domain and PRD-were expressed in E.coli
(Dong et al., 2000b). Analysis of fluorescence and CD spectra indicates that
PHD is a compact globular domain with 20% a-helix and 52% b-structure. The PHD
binds to membrane lipids as well as to plasma membrane and Golgi preparations,
which suggests that PHD may have a major impact on membrane binding of dynamin
II.
CD and fluorescence spectra of the PRD indicate a low content of secondary
structure and the PRD was therefore classified as an unfolded domain. The PRD
interacted weakly with lipids and membranes and binding efficiency was
stimulated by addition of cytosolic proteins. Specific binding of PRD may
depend on the interaction with proteins containing SH3 domains, like
amphiphysin I and II as well as syndapin II, which were identified as major
binding proteins. In addition, binding of dynamin II to Golgi membranes
depends on profilin I (Dong et al., 2000a).
To investigate the effects of PHD and PRD on vesicle biogenesis, purified
domains were added to in vitro budding assays and the formation of
constitutive transport vesicles at the TGN was measured. While the PHD was
neither inhibitory nor stimulatory, addition of PRD inhibited vesicle
formation by 45%. The inhibition was reversed by addition of the SH3 domain of
amphiphysin II. The essential role of the PRD in the dynamin II-mediated
vesicle formation is underlined by the finding that an antibody recognizing
the C-terminus of dynamin II was also strongly inhibitory. To support these
results in an in vivo system, the secretion of pulse-labeled heparansulfate
proteoglycans by 293 cells which overexpress PHD, PRD or PCP under control of
the tet repressor was measured: in PHD expressing cells, the early secretion
was reduced by 27%, in PRD-expressing cells by 39% and in PCP-expressing cells
by 58%. The results indicate that both PRD and PHD are required for proper
function of dynamin II in vivo.
To elucidate the mechanism(s) by which the PRD supports vesicle biogenesis,
proteins which bind to recombinant PRD were identified: amphiphysin I and II
as well as syndapin II directly interacted with PRD via their SH3 domains and
might mediate indirect binding of adaptor protein complexes AP-1 (identified
by g-adaptin), AP-2 (by a-adaptin) and AP-3 (by p47A). In addition, the
endosome-associated protein EEA1 and b-tubulin were identified as binding
proteins of PRD.
Binding of three adaptor protein complexes provides evidence that dynamin II
is involved in exocytic and endocytic pathways. Accordingly, dynamin II was
localized in HeLa cells to the Golgi apparatus, to the plasma membrane and to
spotted cytoplasmic structures, evidently vesicles. The extent of
colocalization between dynamin II and g-adaptin, a-adaptin or p47A differs at
individual sites. PHD and PRD may have distinct effects on the distribution of
dynamin II within the cell: the EGFP-PHD fusion protein localized to the Golgi
area as well as to the plasma membrane of HeLa cells, whereas EGFP-PRD was
predominantly localized to the perinuclear area including the Golgi apparatus.
The inhibition of vesicle formation in vitro by PRD and the inhibition of the
secretion in vivo by expressed PRD or PCP may originate from a competition
between the PRD domain and dynamin II for binding proteins, which was shown to
result in a detachment of dynamin II from the Golgi. As a second effect, an
inhibition of (in vitro) dynamin II oligomer assembly was noted when PRD or
PCP were overexpressed. The requirement of the coiled-coil domain for self-
assembly, published by Sever et al. (Sever et al., 1999), is supported by the
observation that EGFP-PCP but not EGFP-PRD accumulated in large vacuoles in
293 cells, which suggests that PCP forms stable oligomers and attaches
predominantly to a membrane-coated compartment.
The combination of data obtained by different methods, e.g., in vitro vesicle
formation, protein affinity binding and studies on intracellular localizations
have provided compelling evidence that dynamin II-in addition to its known
function in endocytosis-is also required for exocytic and intracellular
vesicle transport pathways. The functions of dynamin II during vesicle
formation at the TGN depend on interactions with membranes via the PHD, on
binding of SH3 domain proteins or polyproline-binding proteins by the PRD and
on oligomerization of dynamin II for which the PRD and the coiled-coil domain
are required.
de
dc.description.abstract
Um die Bedeutung des Dynamin II, eines GTP-Bindungsprotein von 100 kD, für die
Bildung von post-Golgi Transportvesikeln zu untersuchen und den Beitrag
einzelner Proteindomänen nachzuweisen, wurden die Pleckstrin-Homologie Domäne
(PHD), die Prolin-reiche Domäne (PRD) und der C-terminale Teil des Dynamin II
(PCP), bestehend aus der PHD, einer coiled-coil Domäne und der PRD, in E. coli
exprimiert (Dong et al., 2000b).
Die Analyse von Fluoreszenz- und CD-Spektren der PHD weist auf einen hohen
Gehalt an a-Helix (20%) und b-Faltblatt-Struktur (52%) hin, was in Analogie
zur PHD von Dynamin I auf die Ausbildung einer kompakten, globulären Domäne
hindeutet. Die PHD , die mit Membranlipiden interagiert und an Plasmamembran
und Golgizisternen bindet, trägt wesentlich zur Membranbindung des Dynamin II
bei.
Die entsprechenden Spektren der PRD weisen nur auf einen geringen Anteil an
Sekundärstruktur hin, so daß für die PRD eine ungefaltete Konformation
postuliert wird. Die PRD interagiert nur schwach mit Lipiden und Membranen,
wobei die Bindung aber signifikant durch die Zugabe von cytosolischen
Proteinen gesteigert werden kann. Als mögliche Bindungspartner konnten neben
den bekannten SH3-Domänen-Proteinen, Amphiphysin und Syndapin, das Profilin I
identifiziert werden (Dong et al., 2000a).
Um die Bedeutung der einzelnen Proteindomänen für die Vesikelbiogenese zu
bestimmen, wurden PHD bzw. PRD einem zellfreien Ansatz zugesetzt, der die
Bildung konstitutiver Vesikel am trans-Golgi-Netzwerk (TGN) gestattet. Während
die PHD keinen Effekt zeigte, konnte die Vesikelbildung durch die Zugabe der
PRD um bis zu 45% gehemmt werden. Die Hemmung wird durch Zugabe der SH3-Domäne
von Amphiphysin II, die an die PRD bindet, aufgehoben. Die essentielle Rolle
der PRD wird noch dadurch unterstrichen, das ein gegen diese Domäne
gerichteter Antikörper ebenfalls die Vesikelbiogenese hemmt. Um diese Effekte
in einem in vivo-System zu überprüfen, wurde die Kinetik der Sekretion von
Heparansulfat-Proteoglykanen in 293-Zell-Klonen untersucht, die Dynamin II
Domänen unter Kontrolle des tet-Repressor-Operator-Systems exprimieren.
Zellen, die die PHD überexprimieren, zeigten besonders in der frühen Phase der
Sekretion eine Verringering um etwa 27%. Die Expression der PRD hemmte um 39%
und die von PCP um 58%. Die unterschiedliche Effiziens der Hemmung deutet
darauf hin, daß nicht nur die PRD sondern auch die PHD und die coiled-coil
Domäne für die Funktion des Dynamin II notwendig sind.
Um einen Einblick in den Wirkmechanismus der PRD zu erlangen, wurde Proteine
identifiziert, die an rekombinante PRD binden. Während Amphiphysin II und
Syndapin II direkt über ihre SH3-Domäne binden, werden die
Adaptorproteinkomplexe AP1 (identifiziert über g-Adaptin), AP2 (identifiziert
über a-Adaptin) und AP3 (identifiziert über P47A) wahrscheinlich indirekt über
Amphiphysin II gebunden. Zusätzlich wurde die Bindung des Endosomen-
assoziierten Proteins (EEA1) und des b-Tubulins registriert. Die Bindung der
drei Adaptorproteinkomplexe ist ein Hinweis auf die Beteiligung von Dynamin II
an exocytischen und endocytischen Transportprozessen. In Übereinstimmung damit
wird Dynamin II in HeLa-Zellen sowohl am Golgi, wie auch an der Plasmamembran
und an cytoplasmatischen Strukturen, vermutlich an Vesikeln, nachgewiesen.
Durch Immunfluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, daß Dynamin II mit
g-Adaptin, a-Adaptin bzw. P47A kolokalisiert. PHD und PRD beeinflussen die
Spezifität der Bindung offenbar unterschiedlich: das Fusionsprotein aus EGFP
und PHD konnte am Golgi und an der Plasmamembran lokalisiert werden, während
EGFP-PRD vor allem im perinukleären Bereich der HeLa-Zelle, vor allem am
Golgiapparat, nachgewiesen wurde.
Die Hemmung der Vesikelbildung durch PRD und PCP könnte auf eine Kompetition
zwischen den Domänen und dem endogenen Dynamin II um Bindungsproteine
zurückgeführt werden, was sich durch eine Ablösung von Membran-gebundenem
Dynamin II nachweisen läßt. Darüberhinaus wird die Bildung von Dynamin-
Oligomeren durch die Überexpression von PRD oder PCP gehemmt. Dabei scheint
die coiled-coil Domäne des PCP-Konstrukts von besonderer bedeutung zu sein
(Sever et al., 1999), da EGFP-PCP nicht aber EGFP-PRD an der Membran von
Vakuolen in 293-Zellen akkumuliert, was offenbar durch eine verstärkte Bildung
von Oligomeren und eine Erhöhung der Membranaffinität induziert wird.
Die mit verschiedenen Methoden erhaltenen Resultate weisen klar nach, daß
Dynamin II nicht nur, wie bekannt, an der Endocytose beteiligt ist, sondern
daß es auch für die Bildung exocytotischer Transportvesikel am TGN benötigt
wird. Die Funktionen des Dynamin II werden dabei spezifisch durch die
verschiedenen Proteindomänen gesteuert: die PHD vermittelt die Membranbindung,
während die PRD Wechselwirkungen zu Proteinen mit SH3-Domänen oder zu
Polyprolin-bindenden Proteinen herstellt, während die coiled-coil-Domäne die
Oligomerisierung des Dynamin II unterstützt.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
trans-Golgi-Network
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Impact of Dynamin II Domains on the Function of Dynamin II in Vesicle
Formation at the trans-Golgi-Network
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Udo Heinemann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ralf Erdmann
dc.date.accepted
2001-04-25
dc.date.embargoEnd
2001-05-16
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2001000726
dc.title.translated
Die Bedeutung von Domänen des Dynamin II für die Funktion des Dynamin II bei
der Vesikelbildung am trans-Golgi-Netzwerk
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000400
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2001/72/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000400
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access