Studies on the Influence of the Probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 and the Trace Element Zinc on Performance and Digestive Physiological Parameters in the Small Intestine of Piglets

Abstract

Weaning in the early stage of the piglets’ life can lead to post-weaning diarrhoea. For several decades, it was tried to overcome weaning problems by the application of antibiotics, but this has led to the risk of antibiotic resistance. In the last years, the search for natural alternatives as feed additives was immensely enhanced, as it is summarized in Chapter 1. Chapter 2 reviews the current literature about the physiological development in the GIT of piglets with a special emphasis on the critical phase of weaning. Diverse studies in rodent and pig models have revealed that specific dietary factors (such as trace metals or probiotics) can have a major impact on gene expression and on other digestive physiological functions. Therefore, an overview is given on two feeding strategies (probiotics and the trace element zinc) used for this PhD thesis. Besides the ’classical field’ of animal nutrition, other aspects and approaches including enzymatic analysis of digestive enzymes and the respective gene expression, or western blot analysis of specific proteins relevant for digestion and so on, have been taken into account when evaluating feed additives and the respective mode of action. Chapter 3 explains the main aims and hypotheses of this PhD thesis. The main work of the current PhD thesis consists of three published manuscripts summarized in Chapter 4, 5 and 6. The main interest was to increase the knowledge of possible underlying mechanisms of the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 and the trace mineral zinc. Therefore, three studies with suckling or weaning piglets were conducted within this thesis. Furthermore, several protocols for quantitative real-time RT-PCR plus diverse enzyme assays have been established in order to measure activities of disaccharidases (lactase, maltase, sucrase), aminopeptidase-N and intestinal alkaline phosphatase and the respective gene expression in jejunal brush border membranes of the piglets (methods have been published in Martin et al., 2012; Chapter 4). In the first feeding trial, the impact of E. faecium NCIMB 10415 on performance parameters, digestibility and small intestinal digestive measures such as gene expression and digestive enzyme activities has been evaluated in piglets before and after weaning (Chapter 4). The results of the study suggest E. faecium supplementation of sow and piglet diets did not markedly affect physiological parameters associated with digestive function, likely due to good sanitary conditions in this trial. The age-dependent effects on brush border disaccharidase activities and epithelial morphology reflected the weaning transition, as well as maturation and adaptation to feed. Taking all results from the collaboration into consideration (see: Chapter 7), the study failed to prove a positive impact of the tested Enterococcus strain. Whether changes in the activity of intestinal alkaline phosphatase can be associated with other parameters, such as the intestinal microbial ecology or influences on the immune system due to probiotic application, will be determined in future trials. Also of great interest are specific effects of certain probiotic strains when animal health is impaired or when other stress factors exert negative effects on digestive physiological parameters. Therefore, further investigation of probiotic effects in pigs should include challenge conditions via conscious provocation tests with viruses or enteropathogenic bacteria, or studies should be conducted under sanitary conditions which are closer to the situations in farms. The essential trace element zinc as a constituent of over 300 metalloenzymes has been used for decades in high concentrations as a feed additive to prevent or treat diarrhoea in animals and humans. It plays a vital role in the regulation of gene expression, and is seen as a key factor in maintaining different physiological processes. While zinc deficiency impairs growth performance and clinical signs as parakeratosis, high amounts of dietary zinc oxide have been proven in the literature to reduce the incidence of post-weaning diarrhoea, and improve the performance of pigs after weaning (Chapter 2.3). Intestinal zinc uptake is facilitated through members of the zinc transporter families SLC30 (ZnT) and SLC39 (ZIP). Whereas ZIP proteins help to increase intracellular zinc concentration, zinc transport proteins from the ZnT family reduce intracellular concentrations through transport into the extracellular matrix (ZnT1) or into vesicles (ZnT2). The divalent metal-ion transporter 1 (DMT1) appears to play a minor role in zinc homeostasis. Although it has been shown that low levels of dietary zinc can modify the expression of these transporters in the gut and other organs of rodents, the reaction to pharmacological zinc levels is still not fully clarified. Older studies on true zinc digestibility in rats have suggested a homeostatic regulation of zinc absorption. To date, studies about influences of dietary zinc on homeostatic mechanisms in the jejunum of piglets are still lacking. In the studies in Chapter 5 & 6, it was aimed to feed piglets with marginal, normal and high dietary zinc amounts for four weeks after weaning as compared to current nutritional recommendations (GfE, 2006). The main interest of the two studies was to determine whether these different dietary zinc concentrations would have an influence on the performance of the weaned animals, on jejunal mRNA expression or activities of digestive enzymes. Furthermore, investigations on gene expression of the above mentioned specific key zinc transporters (ZnT1, ZnT2, ZnT5, ZIP4, DMT1, MT) played a main role because of their essentiality in maintaining a homeostatic balance in the GIT of the piglets. Furthermore, it has been aimed looking at short-term (1-2 weeks) versus long-term (3-4 weeks) effects of feeding high dietary zinc levels. In both of the current zinc studies, piglets in the HZn group showed a higher ADFI and ADG in the first week post-weaning, suggesting a stimulus on appetite in the HZn group. Furthermore, it was possible to show that high levels of dietary zinc can influence the expression of zinc transporters and zinc- binding proteins in the jejunum of weaned piglets. A decreased jejunal expression of zinc transporter ZIP4 and the increase of the jejunal expression of ZnT1 and MT suggest increased intracellular zinc concentrations, an increased zinc export from intestinal tissues into extracellular compartments and a decreased zinc uptake from the gut lumen at high dietary zinc supply. If there are zinc-dependent transcription factors such as the Krüppel-like factor 4 (KLF4) involved in these processes, needs to be further elucidated for clearance. As the in vitro experiments with the intestinal porcine cell line IPEC-J2 have revealed, the adaptive process appears to be established within 24h; however, it does not prevent the pigs from tissue zinc accumulation in their bone, kidney, pancreas, intestine and liver tissue of the piglets suggesting an overstrained homeostatic regulation. Whether this is the cause for impaired performance during longer supply, as observed four weeks after weaning, needs further clarification. In conclusion, high dietary zinc level improved the performance of piglets in the short-term which means the first two weeks after the weaning. Although we could show that jejunal mRNA levels of key zinc transporters changed with a high dietary zinc supply, this did not prevent the animal from zinc accumulation in various tissues suggesting an outbalanced homeostatic regulation. Besides the evaluation of critical points in the use of high zinc concentrations in pigs’ diets, Chapter 7 tried to contribute to the on-going discussion about the balance between environmental issues and animal health with a model calculation of the use of different zinc dosages in modern pig production.

In der modernen Ferkelproduktion birgt das Absetzen von der Muttersau für die jungen Ferkel ein hohes Stresspotenzial, bedingt durch die Fütterungsumstellung und Rangordnungskämpfe in neuer Umgebung und das Risiko, dass Tiere an Durchfall mit einer hohen Morbidität und Mortalität erkranken. Jahrzehntelang wurden diese absetzbedingten Probleme mittels Verabreichung von Antibiotika umgangen bzw. minimiert, jedoch wird dieses aufgrund des Risikos von Antibiotikaresistenzen kritisch diskutiert. Daher wurden Forschungen zu natürlichen Futterzusätzen als Alternativen zu Antibiotika in den vergangenen Jahren stark intensiviert, was im Rahmen einer Literaturübersicht in Kapitel 1 zusammengefasst wird. Kapitel 2 gibt einen Überblick über den aktuellen Stand der Literatur zur physiologischen Entwicklung des porzinen Verdauungstrakts mit dem Schwerpunkt auf der intestinalen Entwicklung während der kritischen Absatzphase der Ferkel. Diverse Modellstudien am Nagetier bzw. Schwein haben aufgezeigt, dass spezifische Faktoren im Futter, wie zum Beispiel Spurenelemente oder probiotische Kulturen, einen Einfluss auf verdauungsrelevante Stoffwechselvorgänge einschließlich der Genexpression haben können. Deshalb wird ein Überblick über zwei relevante Fütterungsstrategien (Probiotika und das Spurenelement Zink) gegeben, welche die Hauptbestandteile dieser Dissertation sind. Neben den „klassischen“ Fragen der Tierernährung, die mit Parametern zu Leistung und Futteraufwand besondere Relevanz für den Landwirt haben, werden neue Aspekte zur Bewertung von Futterzusätzen und deren Wirkungsweisen, wie z. B. die Analyse verschiedenster Verdauungsenzyme und deren jeweils zugehörige Genexpression oder die Western- Blot-Analyse spezifischer, verdauungsrelevanter Proteine mit einbezogen. Kapitel 3 stellt die Hauptziele und Hypothesen der Dissertation vor. Die drei veröffentlichten Beiträge liegen in Kapitel 4, 5 und 6 vor. Hauptinteresse war dabei, den Wissensstand über mögliche zugrunde liegende Mechanismen und Wirkungsweisen des Probiotikums Enterococcus faecium NCIMB 10415 und des Spurenelements Zink auszubauen. Dazu wurden drei Studien mit Saug- und Absatzferkeln durchgeführt. Diverse Protokolle für die quantitative Real-Time Reverse-Transkriptase-PCR und für die Bestimmung verschiedener Enzymaktivitäten im jejunalen Bürstensaum der Ferkel (Laktase, Maltase und Saccharase sowie intestinale alkalische Phosphatase und Aminopeptidase-N) sind dafür etabliert worden (publiziert in Martin et al., 2012; Kapitel 4). Im ersten Fütterungsversuch wurde der Einfluss von E. faecium NCIMB 10415 auf Leistungsparameter, Nährstoffverdaulichkeit, sowie auf die Genexpression und Aktivität verschiedener Verdauungsenzyme vor und nach dem Absetzen der Ferkel untersucht (Kapitel 4). Das Ergebnis der Studie zeigt, dass die Supplementierung des Sauen- und Ferkelfutters mit E. faecium NCIMB 10415 keinen Einfluss auf die untersuchten verdauungsphysiologischen Parameter hatte, was möglicherweise auf die guten sanitären Bedingungen während des Versuchs zurückgeführt werden kann. Die beobachteten altersbezogenen Effekte auf die Aktivitäten der Bürstensaum-Disaccharidasen und die Dünndarmmorphologie reflektieren altersabhängige Veränderungs- und Anpassungsvorgänge, die mit Darmreifung und der Anpassung an die Festfutteraufnahme einhergehen. Werden die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen aus dem SFB 852 mit in die Evaluierung einbezogen, kann kein positiver Einfluss auf die Tiergesundheit konstatiert werden. Ob jedoch die beobachteten Veränderungen der IAPAktivität mit anderen Parametern wie einer Veränderung der mikrobiellen Zusammensetzung im Darm oder einer Beeinflussung des Immunsystems aufgrund des applizierten Probiotikums assoziiert werden können, muss in zukünftigen Studien weiter untersucht werden. Das Spurenelement Zink, das Bestandteil von über 300 Metalloenzymen ist, wird als Futterzusatz in der Tierernährung, u. a. beim Ferkel, und beim Menschen zur Durchfall-Prophylaxe eingesetzt. Zink spielt eine grundlegende Rolle in der Regulierung der Genexpression und gilt als Schlüsselfaktor zur Aufrechterhaltung lebensnotwendiger physiologischer Stoffwechselprozesse. Während ein Zinkdefizit im Allgemeinen zu Wachstumsverzögerungen und beim Schwein zu Parakeratose führt, wird sehr hohen Zinkoxid-Supplementierungen im Absetzfutter ein positiver Effekt in Bezug auf Leistung und auf die Reduktion von absetzbedingten Durchfallerkrankungen zugeschrieben (Kapitel 2.3). Die intestinale Zinkaufnahme wird im Allgemeinen durch Mitglieder zweier Zinktransporter-Familien ermöglicht, namentlich SLC30 (ZnT) und SLC39 (ZIP). Während es Proteine der ZIP-Familie ermöglichen, die intrazelluläre Zinkkonzentration zu erhöhen, sorgen Proteine der ZnT-Familie durch Zinktransport in die extrazelluläre Matrix (ZnT1) oder in Vesikel (ZnT2) für eine Reduzierung der intrazellulären Zinkkonzentration. Die Rolle des divalenten Metallionen-Transporters DMT1 ist noch nicht abschließend geklärt. Obwohl bereits im Nagetiermodell gezeigt werden konnte, dass niedrige Zinkkonzentrationen im Futter eine modifizierende Wirkung auf die Genexpression dieser Zinktransporter im Jejunum und anderen Geweben haben können, sind die Auswirkungen pharmakologischer Zinkdosierungen beim Schwein noch nicht ausreichend erforscht. Ältere Untersuchungen an Ratten legen eine homöostatische Regulierung der Zinkabsorption nahe. Jedoch fehlten bisher noch Belege für die Effekte pharmakologischer Zinkdosierungen auf mögliche homöostatische Regelmechanismen im Intestinaltrakt des Schweins. Die Versuche in Kapitel 5 & 6 zielten darauf ab, Ferkel über vier Wochen nach dem Absetzen mit marginalen, normalen und sehr hohen Zinkkonzentrationen (verglichen mit aktuellen Fütterungsempfehlungen der GfE, 2006) zu füttern. Eine Hauptintention bestand darin, Einflüsse auf Leistungsparameter sowie die Expression und Aktivität diverser Verdauungsenzyme im Jejunum zu untersuchen. Weiterhin spielten die Untersuchungen der Genexpressionen der Transportproteine (ZnT1, ZnT2, ZnT5, ZIP4, DMT1, Metallothionein) aufgrund ihrer Bedeutung in der Aufrechterhaltung der Zink-Homöostase im Darm der Ferkel eine große Rolle. Ein nicht unwesentliches Ziel war zudem der Zeitaspekt der Zinkfütterung, insbesondere, ob in der kurz- (1-2 Wochen) oder längerfristigen (3-4 Wochen) Gabe hoher Zinkmengen verdauungsphysiologische Unterschiede beim Ferkel festgestellt werden können. In beiden Studien zeigten die Tiere in der Gruppe mit der hohen Zinksupplementierung in der ersten Woche nach dem Absetzen eine höhere tägliche Futteraufnahme sowie eine höhere tägliche Gewichtszunahme, was auf eine appetitstimulierende Wirkung hindeuten könnte. Weiterhin war es möglich zu zeigen, dass eine hohe Zinkzufuhr mit dem Futter die Expression verschiedener Zinktransporter (ZnT1, ZIP4) und zinkbindender Proteine (Metallothionein) im Jejunum der Absatzferkel beeinflusst. Eine verringerte jejunale Expression des ZIP4 und eine gesteigerte Expression des Zinktransporters ZnT1 und des Zink bindenden Proteins Metallothionein während der hohen Zinksupplementierung lassen auf erhöhte intrazelluläre Zinkkonzentrationen, einen erhöhten Zinkexport aus dem Darmgewebe in extrazelluläre Kompartimente sowie auf eine verringerte Zinkaufnahme aus dem Darmlumen schließen. Ob an diesen Prozessen weitere zinkabhängige Transkriptionsfaktoren, wie z. B. der Krüppel-like factor 4 (KLF4), beteiligt sind, muss in weiterführenden Experimenten untersucht werden. In vitro-Experimente mit der porzinen Zelllinie IPEC-J2 konnten zeigen, dass sich dieser Adaptierungsprozess auf Genebene innerhalb der ersten 24 Stunden manifestiert. Trotz effizienter Regulation der Transporterexpression waren die Tiere nicht vor einer Zinkakkumulierung in Knochen-, Nieren-, Pankreas-, Darm- und Lebergewebe geschützt. Die Daten deuten auf eine Überforderung der Zinkhomöostase hin. Ob dies als Grund für eine verminderte Leistung der Tiere während längerfristiger hoher Zinksupplementierung verantwortlich gemacht werden kann, muss in weiteren Studien geklärt werden. Zusammenfassend zeigt sich, dass hohe Zinkkonzentrationen in der Fütterung helfen können, die Leistung von Absatzferkeln kurzfristig, d. h., in den ersten beiden Wochen nach dem Absetzen, zu verbessern. Die Ergebnisse der längerfristigen Messungen zeigen eine unausgeglichene Zinkhomöostase. Neben der Evaluierung kritischer Aspekte des hohen Zinkeinsatzes im Futter von Absetzferkeln wurde in Kapitel 7 versucht, mittels Modellrechnungen einen Beitrag zur anhaltenden Diskussion über umweltrelevante Aspekte der Zinkfütterung und der Tiergesundheit durch kurzfristig hohe Zinkgaben in der Tierproduktion zu leisten.