Untersuchungen zur Regulation des Zelltodes durch Wechselwirkungen zwischen Proteinen des Poly (ADP-Ribose) Metabolismus

Abstract

Bei der Poly (ADP-Ribosyl)ierung handelt es sich um eine posttranslationale Modifikationsreaktion, deren Bedeutung für zahlreiche zelluläre Prozesse wie der Regulation des Zellzyklus, der DNA-Reparatur sowie dem Zelltod gezeigt wurde. Während die Synthese von Poly (ADP-Ribose) (PAR) und die Poly (ADP- Ribose) Polymerasen (PARPs) intensiv untersucht wurden, sind nur wenige Informationen zur Funktion des Polymer-abbauenden Enzyms, der Poly (ADP- Ribose) Glycohydrolase (PARG) vorhanden. Ziel der Arbeit war es, mit der Identifizierung von Interaktionspartnern und in daran anschliessenden funktionellen Studien, das Verständnis für die Funktion der PARG grundlegend zu erweitern. Dafür erfolgte zunächst die Klonierung der humanen PARG- cDNA aus der Krebszelllinie HeLa S3. Die Analyse der Primärstruktur der PARG zeigte, dass alle für die zelluläre Verteilung und den Katalysemechanismus essentiellen Aminosäuren enthalten waren. In den folgenden Experimenten zur heterologen Anreicherung des Proteins in E. coli, wurde zum ersten Mal die Expression sowohl der katalytische Domäne (PARG65) als auch der vollständigen humanen PARG (PARG110) als lösliche Polyhistidinfusionsproteine gezeigt. Die anschliessende Reinigung der katalytischen Domäne durch Ni-NTA- Affinitätschromatographie ermöglichte ausserdem die erstmalige Gewinnung eines polyklonalen Antikörpern, gerichtet gegen die humane PARG. Da eine Reinigung der kompletten PARG110 als Polyhistidinfusionsprotein mittels Ni-NTA- Chromatographie nicht möglich war, wurde als Alternative eine Affinitätsmatrix mit Gallotanninen, beschriebene Inhibitoren der PARG, entwickelt. Die erfolgreiche Immobilisierung der humanen PARG an diese Matrix ermöglichte anschliessende Protein-Protein-Interaktionsstudien. Dabei konnte erstmalig eine spezifische Protein-Protein-Interaktion zwischen den Enzymen PARP-1 und PARG gezeigt werden. Durch den Einsatz von Deletionsmutanten wurde der Bereich der Interaktion auf die katalytische Domäne der PARG und die Automodifikationsdomäne der PARP-1 eingegrenzt. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass die PARG in der Lage ist die katalytische Aktivität der PARP-1 in humanen Kernextrakten direkt zu beeinflussen. Ausserdem wurde eine Interaktion der PARG mit X-ray repair cross-complementing 1 (XRCC1), einem für die DNA-Reparatur essentiellen Protein nachgewiesen. Da XRCC1 sowohl mit PARP-1 als auch der PARG interagiert, wurde die zelluläre Funktion dieses Proteins für den PAR-Metabolismus modellhaft in Hamsterovarienzellen mit Expression von XRCC1 (EM9-XH) und ohne Expression von XRCC1 (EM9-V) untersucht. Erfolgte eine Schädigung beider Zelllinien mit einer letalen Dosis des alkylierenden Agenz N-Methy-N´-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), so wurde eine deutlich stärkere Akkumulation von PAR in den EM9-XH- Zellen beobachtet. Die Relevanz der XRCC1-abhängigen PAR-Induktion wurde anschliessend hinsichtlich der Induktion des Zelltodes untersucht. In den XRCC1-exprimierenden Zellen erfolgte MNNG-abhängig die Translokation des Apoptose induzierenden Proteins AIF (apoptosis inducing factor) vom Mitochondrium in den Zellkern. Die folgende Chromatinolyse (nuclear shrinkage) des Zellkerns führte caspase-unabhängig zum Zelltod. Im Unterschied dazu starben die XRCC1-defizienten EM9-V- Zellen infolge der Absenkung der zellulären ATP- und NAD+-Spiegel nekrotisch, ohne vorhergehende AIF- Translokation und Chromatinolyse. In allen höheren Organismen wird der Erhalt des Genoms durch funktionierende DNA-Reparaturprozesse gewährleistet. Sind diese Mechanismen überlastet, kann eine gezielte Einleitung des Zelltodes erfolgen, um der genetischer Instabilität entgegenzuwirken und die Entwicklung von Krebs zu verhindern. Die Ergebnissse dieser Arbeit zeigen, dass die funktionellen Interaktionen zwischen PARG, PARP-1 und XRCC1 von fundamentaler Relevanz für die genomische Integrität sind.

Poly (ADP-ribosyl)ation is a posttranslational modification, known to be involved in several cellular processes as regulation of cell cycle, DNA repair and cell death. While synthesis of poly (ADP-ribose) (PAR) and the function of Poly (ADP-ribose) polymerases (PARPs) were studied extensivly, only little is known about the polymere degrading enzyme Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). First aim of this study was the identification of PARG interacting proteins. Further characterizations were intended to provide more insightes into the cellular functions of the PARG. Initially, the human PARG cDNA from the cancer cell line HeLa S3 was cloned. The analysis of the primary protein structure revealed the presence of all amino acids, essential for cellular distribution and the mechanism of catalysis. For the first time human PARG, catalytic domain (PARG65) as well as full length protein (PARG110), were expressed as soluble polyhistidin tagged fusion proteins in E. coli. Purification of the catalytic domain of PARG using Ni-NTA affinity chromatography enabled the generation of polyclonal antibodies directed against human PARG. Since purification of the full length PARG using Ni-NTA affinity chromatography was impossible, an affinity matrix composed of sepharose beads covalently linked to gallotannins, which are described as PARG inhibitors, was established. Subsequently, interactions between gallotannin sepharose immobilized PARG and other nuclear proteins were studied. A direct protein protein interaction between the enzymes PARP-1 and PARG was demonstrated. Using deletion mutants of both proteins the automodification domain of PARP-1 and the catalytic domain of PARG were identified as interacting regions. Functional experiments indicated that PARG downregulates the enzymatic activity of nuclear PARP-1. In addition, PARG interacts with X-ray repair cross-complementing 1 (XRCC1), a DNA repair factor which is recruited by PARP-1. To study the impact of XRCC1 on PAR metabolism and regulation of cell death hamster ovary cell lines either deficient in XRCC1 (EM9-V) or overexpressing XRCC1 (EM9-XH) were used. Treatment with supralethal doses of the alkylating agent MNNG caused a considerable accumulation of PAR only in EM9-XH cells. Consequently, MNNG triggered in XRCC1- proficient cells the translocation of apoptosis inducing factor (AIF) from mitochondria to the nucleus. This was followed by nuclear shrinkage and caspase-independent cell death. In XRCC1-deficient cells, a same MNNG treatment caused ATP and NAD depletion, resulting in necrotic cell death without AIF translocation and nuclear shrinkage. Efficient progression of both DNA repair and apoptosis are essential for genomic integrity. The results of present study demonstrate, that the interactions between PARG, PARP-1 and XRCC1 are important for the regulation of both processes.