Design, synthesis, and evaluation of MMP-11 FRET substrates for the early detection of pancreatic cancer

Abstract

Pancreatic cancer is a major cause of cancer death in North America and Europe with a median survival rate of less than 6 months. Lack of symptoms and a dearth of diagnostic methods for its detection lead to its having one of the most dismal prognoses in all of medicine. Conventional imaging techniques detect tumors only at a minimum diameter of 1 cm at which point it has usually already reached malignant stage. The only treatment so far developed is that of pancreatic resection, but even when performed at an early stage, this treatment increases the 5-year survival rate to only 30%.[1] Therefore, as part of the EU project “Novel molecular diagnostic tools for the prevention and diagnosis of pancreatic cancer” (MolDiag-PaCa), several target genes were identified with the help of a gene expression data analysis. This analysis included overexpressed genes in pancreatic ductal adenocarcinomas (PDAC) that are not expressed in normal ductal cells, acinar cells and pancreatitis. Focus was placed on Matrix Metalloprotease 11 (MMP-11), a protease identified as a tumor biomarker that can be addressed by imaging substrates cleaved by MMP-11. Consequently, a library of FRET-substrates as synthesized and successfully evaluated in vitro in a FRET assay while cleavage substrates were identified via LC/MS-TOF. The lead candidate SM P 124 (kcat/KM = 9160 M-1s-1) subsequently tested 20 times more selective for MMP-11 than comparable substrates with similarly high activity. Cellular assays confirmed cleavage with MMP-11 overexpressing cells, while no fluorescent signal was observed with negative control cell line Jurkat. The probe was further developed for in vivo imaging by coupling the substrate to a copolymeric support (pHPMA) and designing the latter for near infrared (NIR) imaging. Transgenic tumor mice administered with the fluorescein-labeled copolymersupported probe showed a strong fluorescent signal of the pretumorous pancreas, while control mice exhibited only weak background fluorescence. MIA PaCa-2 xenografts that were tested with NIRF-labeled substrate-copolymer conjugates also revealed a strong fluorescent tumor 24 h to 48 h after tail vein injection of the tracer and thereby successfully demonstrated for the first time imaging of MMP-11 activity in vivo. In order to obtain spatially resolved images of MMP-11 activity, the probes were further developed for hyperpolarized (hp) 129Xe imaging.

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist eine der Hauptursachen von Krebstodesfällen in Nordamerika und Europa mit einer mittleren Überlebensrate von nur 6 Monaten. Das Fehlen von Symptomen sowie diagnostischen Methoden führt in allen Fällen zur schlimmsten Prognose. Sektion der Bauchspeicheldrüse ist bisher die einzige Behandlungsmethode, die, wenn sie frühzeitig durchgeführt wird, die 5-Jahres Prognose auf 30 % hebt.[1] Konventionelle Imaging Methoden erkennen einen Tumor ab einer Größe von 1 cm, wonach eine Heilung bereits ausgeschlossen ist. Deshalb wurden, als Teil des Framework 6 EU Projektes “Novel molecular diagnostic tools for the prevention and diagnosis of pancreatic cancer” (MolDiag-PaCa) Zielgene identifiziert mit Hilfe einer Genexpressionsanalyse, die überexprimierte Gene in duktalen Adenocarzinomen berücksichtigt, die nicht in normalem Gewebe, Acinar Zellen oder in der Pankreatitis überexprimiert sind. Matrix Metalloprotease 11 (MMP-11) wurde als Biomarker für Bauchspeicheldrüsenkrebs identifiziert und validiert. Proteasen wie MMP-11 können durch Fluoreszenz-markierte Substrate adressiert werden, die durch MMP-11 geschnitten werden. Eine Substratbibliothek wurde daher synthetisiert und in vitro evaluiert mittels eines FRET Assays und nachfolgender Identifizierung der Spaltprodukte per LC/MS-TOF. Das kombinierte, aktivste Substrat SM P 124 (kcat/KM = 9160 M-1s-1) wurde außerdem auf seine Aktivität gegenüber MMP-14 getestet wobei es 20 mal selektiver ist als vergleichbare Substrate mit ähnlich hoher Aktivität für MMP-11. Zelluläre Assays bestätigten Substratumsatz mit MMP-11 überexprimierenden Zellen und zeigten keinen Umsatz mit der negativen Kontrollzelllinie Jurkat. Konfokalmikroskopieaufnahmen zeigten weiterhin nur wenig fluoreszierendes Hintergrundsignal eines negativen Kontrollsubstrates, im Gegensatz zum MMP-11 Substrat SM P 124, welches eine starke Färbung der Lösung, sowie Membran und Vesikeln zeigte. Kein Signal wurde beobachtet mit der Kontrollzelllinie Jurkat. Zusätzlich wurde die Sonde als Imaging-Tracer weiterentwickelt, indem das Substrat an ein Copolymer gekuppelt wurde. Das Copolymer-Substrat Konjugat wurde erfolgreich in vivo in transgenen Tumormäusen und MIA PaCa-2 Xenograften getestet, die eine hochfluoreszente Bauchspeicheldrüse zeigten, wobei Kontrollmäuse kein Signal zeigten. Für nichtinvasive Bildgebung wurde zusätzlich eine Nahinfrarot (NIR) Probe entwickelt, deren Aktivität in MIA PaCa-2 Xenograften getestet wurde und fluoreszierende Tumoren lieferte. Um eine räumliche Zuordnung des Signals zu gewährleisten wurde außerdem die Fluoreszein-markierte Sonde weiterentwickelt für Imaging mit hyperpolarisiertem (hp) Xenon 129Xe.