Charakterisierung zielgerichteter Fusionsproteine und Etablierung eines murinen Kolonkarzinom-Modells für die Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy

Abstract

Die zielgerichtete Tumortherapie kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Beispiele hierfür sind die Tumortherapie mit Proteintoxinen, die Immunotherapie mit therapeutischen Antikörpern und die Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT). Letztere zeichnet sich durch die Verwendung von speziellen Fusionsproteinen aus, die sowohl eine zielgerichtete Proteinkomponente, als auch eine Komponente mit enzymatischer Aktivität beinhalten. Eine große Menge einer nicht toxischen Substanz (Prodrug) wird in dem adressierten Gewebe in kurzer Zeit durch das Enzym in eine cytotoxische Substanz (Drug) umgesetzt. Diese lokale Toxizität ermöglicht die Reduktion von Nebenwirkungen, die bei einer systemischen Verabreichung von Chemotherapeutika auftreten können. Das Drug ist membranpermeabel und diffundiert auch in benachbarte Zellen. Diese cytotoxische Wirkung auf das Tumorstroma wird als Bystander Effect bezeichnet und verstärkt den anti-tumoralen Therapieeffekt durch Schädigung des tumorversorgenden Gewebes. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene ADEPT-Fusionsproteine untersucht, die in Hinblick auf ihre Anwendung in der zielgerichteten Tumortherapie näher charakterisiert wurden. Beide Proteine verfügen über die in Hefen vorkommende Cytosindeaminase (CDy) und unterscheiden sich in der Bindungsspezifität aufgrund verschiedener Einzelkettenantikörperfragmente (scFv). Das ADEPT-Fusionsprotein L19CDy-His beinhaltet den scFv L19, der eine hohe Affinität zur Extra Domain B (ED-B) aufweist. Die ED-B kommt ausschließlich in einer Splicevariante des humanen Fibronektins vor, welches während der Angiogenese in der extrazellulären Matrix gebildet wird. Die Entwicklung des Tumorgewebes geht mit der Angiogenese einher, sodass die ED-B eine geeignete Struktur für die Etabilierung einer zielgerichteten Tumortherapie darstellt. Das ADEPT- Fusionsprotein L19CDy-His wurde als Voraussetzung für seinen Einsatz in der Tumortherapie in vitro charakterisiert. In diesem Zusammenhang wurde die zielgerichtete Komponente in Bezug auf ihre Bindungsaffinität untersucht. Die dabei bestimmte Dissoziationskonstante belegt eine moderate Bindungsaffiniät zu ED-B mit einem Wert von 81 ± 7 nM. Die enzymatische Aktivität des Fusionsproteins wurde ebenfalls bestimmt, da diese die grundlegende Voraussetzung für die Bildung des cytotoxischen Drugs darstellt. Die Enzymaktivitätsassays mit L19CDy-His zeigten, dass die Aktivität durch die Fusion mit dem scFv L19 nicht beeinflusst wurde. Auch die Untersuchungen der enzymatischen Aktivität nach Inkubation mit humanem Plasma verdeutlichten die Stabilität von L19CDy-His. Die Aktivität in humanem Plasma sank innerhalb weniger Stunden auf 75 % des Ausgangswertes, blieb dann jedoch über einen Verlauf von drei Tagen stabil. Die In-vitro-Untersuchungen mit ED-B+ und ED-B- Tumorzelllinien zeigten eine hervorragende cytotoxische Wirkung, deren Spezifität dadurch belegt werden konnte, dass ausschließlich die Vitalität der ED-B exprimierenden Zellen in der ADEPT mit L19CDy-His erfolgreich reduziert wurde. Neben dem ADEPT-Fusionsprotein L19CDy-His wurden auch Untersuchungen zur Wirkung der Therapie mit antiA33-CDy durchgeführt. Der scFv antiA33 bindet spezifisch an das humane Glykoprotein A33 (hgpA33), welches in 95 % aller Kolonkarzinome überexprimiert wird und damit eine optimale Zielstrukur darstellt. Das Fusionsprotein antiA33- CDy wurde bereits von Panjideh et al. charakterisiert. Die zuvor gewonnenen Erkenntnisse aus In-vitro-Studien und einer Pilotstudie zur anti-tumoralen Wirkung in athymischen Nacktmäusen belegten die potentielle anti-tumorale Wirkung, die in dieser Arbeit detailliert in vivo untersucht werden sollte. Hierfür wurde eine BALB/c-syngene Tumorzelllinie generiert, die die antiA33-CDy-Zielstruktur hgpA33 exprimiert. Die Etablierung dieses Kolonkarzinom-Modells ermöglichte die ADEPT in vivo zu testen und deren Einfluss auf das murine Immunsystem zu analysieren. Die Therapie hgpA33+ Tumore hatte eine antiA33-CDy- konzentrationsabhängige Reduktion der Tumormasse zur Folge, die signifikante Unterschiede zwischen den behandelten und nicht behandelten Gruppen aufzeigte. Besonders ist hierbei hervorzuheben, dass die Tumore bei allen Mäusen der Gruppe, die die größte Menge des Fusionsproteins antiA33-CDy erhielten, vollständig reduziert werden konnten. Die vielversprechenden In-vivo- Ergebnisse zu antiA33-CDy und die ausgezeichneten Resultate zu L19CDy-His ebnen den Weg dieser Fusionsproteine für den Einsatz in der zielgerichteten Tumortherapie, die aufgrund des gleichen Enzyms/Prodrugs auch in einer dualen Therapie münden könnte.

Targeted tumor therapies can be implemented in different ways, e.g., protein toxin therapy, the immunotherapy with therapeutic antibodies, and the Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT). The latter is characterized by fusion proteins containing both a targeting and an enzymatic moiety. The targeting moiety directs the fusion protein to a specific targeted tissue, where the enzymatic moiety converts a non-toxic substance (prodrug) into a cytotoxic substance (drug). The resulting local effect reduces side effects usually occurring due to systemic administration of chemotherapeutics. Additionally, the enzyme rapidly converts a large number of prodrug molecules into drug molecules. The drug is membrane permeable and diffuses in neighboring cells as well. This bystander effect on the tumor stroma enhances the efficacy of the anti-tumor treatment by damaging tumor-supplying tissue. In this work, two different fusion proteins have been investigated and characterized in regard to their application in the targeted tumor therapy. Both therapeutic proteins are fusions of yeast cytosine deaminase (CDy) to different targeting moieties, i.e. different single chain fragment variables (scFv). The ADEPT fusion protein L19CDy-His contains the scFv L19, which binds the Extra Domain B (ED-B) with high affinity. ED-B is a splice variant of the human extracellular matrix protein fibronectin, which is exclusively expressed during angiogenesis. The tumor development is depended on angiogenesis, thus ED-B is a suitable structure for the establishment of a targeted tumor therapy. The fusion protein L19CDy-His has been characterized in this work in vitro with regard to the targeted tumor therapy. Therefore, the binding affinity of L19CDy-His to ED-B was determined. The analysis resulted in a moderate binding affinity to ED-B with a dissociation constant of 81 ± 7 nM. The enzymatic activity is the main prerequisite in drug development and was therefore determined for L19CDy-His. The analyses documented that the activity of CDy was not decreased upon fusion to the scFv L19. Studies with human plasma preincubation displayed the stability of L19CDy-His, as the enzymatic activity was reduced to 75% within few hours, however, remained stable for three days. In-vitro-investigations on ED-B-expressing and ED-B-negative tumor cells clearly demonstrated a magnificent cytotoxic effect and a high specificity by affecting selectively ED-B-expressing cells. Beside L19CDy-His, the therapeutic efficacy of the ADEPT fusion protein antiA33-CDy was investigated. The scFv antiA33 interacts with the human glycoprotein A33 (hgpA33) that is strongly expressed in 95% of all colorectal carcinoma. The fusion protein antiA33-CDy has been characterized by Panjideh et al. In-vitro- investigations and a pilot study on the anti-tumorigenic effect with athymic nude mice showed some anti-tumorigenic potential, which was investigated in detail in this work. Therefore, a hgpA33+ BALB/c-syngeneic tumor cell line was generated. This colorectal carcinoma model facilitated the analysis of ADEPT with antiA33-CDy in vivo and the investigation of the influence of antiA33-CDy on the murine immune system. The therapy of hgpA33+ tumors showed an antiA33-CDy concentration-dependent reduction of tumor mass and significant differences in tumor masses between treated and non-treated groups. Of particular note, the mice treated with the highest amount of antiA33-CDy achieved a complete remission without any side effects. This promising result and further excellent data obtained with L19CDy-His demonstrate the suitability of both fusion proteins for tumor therapy. Furthermore, these fusion proteins could potentially be used in a combined administration based on their need for the same prodrug.