In vitro Skin Disease Equivalents and their Applications in Basic Dermatologic Research

Abstract

Atopic dermatitis, also referred as atopic eczema, is one of the most common chronic inflammatory skin diseases and the phenotype adversely affects the quality of life of patients significantly. Despite the high predictive power of reconstructed human skin, in vitro approaches for AD have not been widely introduced into preclinical drug research. Our lacks of understanding of the disease pathogenesis as well as the unmet clinical need for new therapeutic options in the field of AD ask for the development of predictive skin disease equivalents that accurately reflect the disease. In order to create reliable skin equivalents that contribute to the understanding and treatment of skin diseases, appropriate tools and the current knowledge of the pathogenesis are necessary to transfer the condition of the disease into the in vitro approach. In the first step, cytokine exposure in skin equivalents was combined with a genetically derived FLG deficiency for the first time, permitting the influences and interdependencies of these two key AD hallmarks to be investigated systematically. Histology, surface pH and disease related protein expression (FLG ↓, TSLP↑) in the exposed skin equivalents closely resemble acute lesions in AD patients. Distinct up-regulation of different skin barrier and tight junction proteins initially compensate for the lack of functional FLG, resulting in a similar phenotype (e.g. surface pH and skin barrier function) as in healthy models. For the first time, a direct link between FLG deficiencies and the innate immune response were demonstrated by the upregulation of AMP expression. Dramatic downstreaming effects after cytokine exposure found for all compensatory mechanism (except TSLP) strengthened the hypothesis that Th2 inflammation might constitute the main trigger for the disease within the body. To identify the optimal topical drug delivery system for evaluation in the skin disease equivalents, promising nanocarrier candidates were characterized in terms of their physicochemical properties, biocompatibility and, in particular, drug deliver efficacy into human skin. Thus, essential differences between the various carrier systems were revealed, primarily dependent on their chemical composition. Unlike other carriers that exhibited drawbacks in one or two of the necessary requirements for efficient drug delivery systems, the CMS nanocarriers and tNG turned were biocompatible, stable, and effectively delivered small molecules into excised human skin. They clearly outperformed the conventional and widely used cream formulation in terms of drug delivery and demonstrated excellent biocompatibility towards skin derived cells and immune cells. Finally, the developed skin disease equivalents were able to prove the promising results of both carrier systems from the ex vivo evaluation by establishment of various read-out parameters. The successful delivery of therapeutic proteins through the skin barrier by tNG was shown along with the first demonstration of their anti-inflammatory pharmacological activity in the skin disease equivalents. After chemical modification with cyclodextrin, the tNGs were even able to deliver DXM in an efficient manner. The altered pharmacokinetics of DXM absorption after topical application of loaded CMS nanocarriers was verified with faster glucocorticoid receptor activation in the viable epidermis. Consequently, as seen in several different studies, stronger anti-inflammatory effects were seen compared to the standard treatment as demonstrated by significant reduction of key pathological AD proteins like TSLP and pro-inflammatory cytokine such as IL-6/IL-8. In summary, the results, described in the thesis show that the developed AD skin disease equivalents present certain characteristics of lesional AD. They also demonstrate reconstructed diseased skin is valuable for basic biological research as well greatly useful for pharmacodynamic evaluation. In terms of in vitro AD research, relevant pathways, read-out parameters and corresponding techniques were demonstrated for efficacy assessment of topical pharmaceutical approaches/drugs.

Atopische Dermatitis, auch bekannt als atopisches Ekzem, ist eine chronisch- entzündliche Hauterkrankung mit hoher Prävalenz, deren Erscheinungsbild die Lebensqualität der betroffenen Patienten massiv beeinträchtigt. Der klinische Bedarf an wirksamen Arzneimitteln für Patienten sowie die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der zugrundeliegenden Pathogenese erfordert die Entwicklung prädiktiver Hautmodelle mit entsprechenden Eigenschaften. Trotz der hohen Aussagekraft von rekonstruierten humanen Hautmodellen, werden solchen in vitro Methoden zur Erforschung der Erkrankung bisher nur begrenzt eingesetzt, meist aufgrund von Mangel an geeigneten Krankheitsmodellen. Um prädiktive und verlässliche Modelle der atopischen Dermatitis generieren zu können, welche in der Lage sind einen Beitrag für erfolgreiche präklinische Forschung zu leisten, ist es notwendig den aktuellen Wissenstand der Forschung zu kennen und diesen in ein solches in vitro Konzept zu überführen. Im ersten Schritt wurden die pathologischen Parameter der FLG Defizienz und der Zytokinexposition zum ersten Mal gleichzeitig in einem Hautmodell integriert, vor allem um deren Wechselbeziehung systematisch zu untersuchen. Kompensatorische Hochregulierungen von Hautbarriere- und Tight Junction Proteinen, bedingt durch das Fehlen von FLG, führen dazu, dass zunächst kaum eine Veränderung des Phenotypes im Vergleich zu gesunden Hautmodellen festzustellen war. Durch die gezeigte Hochregulation von antimikrobiellen Peptiden, wurde erstmals eine direkte Verbindung zwischen der angeborenen Immunantwort und der FLG Defizienz gezeigt. Die charakterisierten Hochregulationen in den Hautmodellen wurden durch die Zytokinexposition gravierend gestört, was die Hypothese bekräftigt, dass die Entzündung innerhalb des Körpers als ein Hauptstimulus für das Fortschreiten der Erkrankung zu sehen ist. In den krankheitsspezifischen Merkmalen Histologie, Hautoberflächen pH und Proteinexpression (FLG ↓, TSLP ↑) ist vor allem in den zytokinbehandelten Hautmodellen eine deutliche Ähnlichkeit zu akuten Läsionen in Patienten zu erkennen. Um das bestmögliche topische Transportsystem für die pharmakologische Evaluierung auf dem Krankheitsmodell zu identifizieren, wurden verschiedenste Nanotransportersysteme in Bezug auf deren Eigenschaften (Physikochemie, Toxizität, Transporteffizienz in Humanhaut) charakterisiert. Dabei wurden essentielle Unterschiede der verschiedenen Systeme identifiziert, vor allem in Abhängigkeit der chemischen Zusammensetzung. Einige Nanotransporter zeigten dabei deutliche Nachteile in wichtigen Voraussetzungen für den Einsatz als Transportsystem, aber thermoresponsive Nanogele (tNG) und CMS Nanotransporter stellten sich als die vielversprechendsten Konzepte heraus. Sie übertrafen deutlich die konventionelle Creme Formulierung in Sachen Transporteffizienz und zeigten eine herausragende Komptabilität gegenüber epidermalen Zellen und Immunzellen. Die positiven Ergebnisse der Evaluierung beider topischer Transportsysteme konnten abschließend auf den entwickelten Krankheitsmodellen mithilfe verschiedener Parameter bestätigt werden. Durch messbare anti-entzündliche Effekte konnte zum ersten Mal der durch die Nanogele ermöglichte Transport eines wirksamen Proteinarzneistoffs in seiner aktiven Form verifiziert werden. Die veränderte Pharmakokinetik des topischen Dexamethasontransportes, bedingt durch die Applikation mittels CMS Nanotransporter konnte durch eine schnellere Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors auch pharmakologisch überprüft werden. Mithilfe der Reduktion von TSLP, einem Schlüsselprotein in der AD Pathogenese, sowie der Reduktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-8, wurden stärkere anti-entzündliche Effekte im Vergleich zur entsprechenden Standardtherapie mit Dexamethason Creme beobachtet. Die Ergebnisse der Dissertation veranschaulichen die Entwicklung von Krankheitsmodellen der Haut, welche bestimmte Charakteristika von Läsionen der atopischen Dermatitis aufweisen. Es wird deutlich, dass die rekonstruierten Hautmodelle einen wertvollen Beitrag zur biologischen Forschung als auch zur pharmakologischen Evaluierung leisten können. Zum ersten Mal konnte die Effektivität neuer topischer Therapieansätze mittels relevanter Parameter und entsprechenden Techniken in einem humanbasierten in vitro System krankhafter Haut gezeigt werden.