Verwendung fluoreszenzmarkierter Sonden zur direkten Identifizierung und Visualisierung von Mikroorganismen in der klinisch-mikrobiologischen Diagnostik

Abstract

In verschiedenen Bereichen der medizinischen Mikrobiologie erweisen sich die konventionellen, kulturbasierten Verfahren zur Diagnostik von Mikroorganismen insbesondere bei schwer anzüchtbaren Erregern oder antimikrobieller Vorbehandlung des Patienten als zeitaufwändig und oft erfolglos. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine molekularbiologische, kulturunabhängige Methode, die die direkte Visualisierung und Identifizierung von Mikroorganismen im Gewebe ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Evaluation der FISH für die mikrobiologische Diagnostik bei septischen Krankheitsbildern (Kapitel 1.3) sowie die Visualisierung von Mikroorganismen in Geweben in situ (Kapitel 1.4). 1.) Septische Krankheitsbilder: In dieser Arbeit wurde die FISH zur mikrobiologischen Diagnostik der Sepsis und infektiösen Endokarditis (IE) entwickelt und angewendet. Im Bereich der Sepsisdiagnostik wurde eine FISH-Sondenkombination zur Identifizierung Gram-positiver Kokken entwickelt und auf 428 Blutkulturproben angewendet. Mit hoher Sensitivität und Spezifität gelang innerhalb von 3 Stunden die Erregeridentifizierung. Bei IE ist die mikrobiologische Diagnose und Therapie durch den hohen Anteil Blutkultur- negativer Fälle problematisch. In dieser Arbeit wurden in 26 von 54 Herzklappenproben durch FISH Mikroorganismen nachgewiesen. Darunter waren 5 kulturnegative Fälle mit teilweise schwer anzüchtbaren Erregern wie T. whipplei oder B. quintana. 2.) Visualisierung von Mikroorganismen in situ: Die direkte Visualisierung von Mikroorganismen in situ in Gewebsschnitten erfolgte in resezierten Herzklappen sowie in Darmbiopsien bei humaner intestinaler Spirochätose (HIS). In Herzklappen von Patienten mit IE gelang durch FISH die Differenzierung zwischen Kontamination und pathogenen Mikroorganismen sowie die Visualisierung komplexer bakterieller Biofilmstrukturen im Gewebe. HIS wird durch Spirochäten des Genus Brachyspira hervorgerufen und kann zu chronischen gastrointestinalen Beschwerden führen. Da die Kultivierung von Brachyspira spezielle Nährböden und Inkubationszeiten von 2-6 Wochen erfordert, wird die Diagnose häufig nicht gestellt. In dieser Arbeit wurde eine Brachyspira-genusspezifische FISH-Sonde entwickelt, und es gelang eine detaillierte Darstellung und Identifizierung der Brachyspira spp. in Darmbiopsien von 5 Patienten. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die FISH als ergänzende Methode in der mikrobiologischen Diagnostik insbesondere bei IE und HIS geeignet ist. In prospektiven klinischen Studien muss nun überprüft werden, inwieweit dadurch das Management dieser Krankheitsbilder verbessert werden kann. Die FISH als Verbindung zwischen histopathologischen und molekularbiologischen Techniken könnte auch in weiteren Bereichen der medizinischen Mikrobiologie vorteilhaft sein.

Culture-based techniques for identification of microorganisms in medical microbiology are often insufficient or time-consuming because of slow growth or fastidious nature of the microorganisms or previous antibiotic therapy. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a molecular, culture-independent method which allows direct visualization and identification of microorganisms in situ. The aim of this study was to evaluate FISH as a diagnostic tool for sepsis, infectious endocarditis and human intestinal spirochaetosis. For rapid identification of Gram-positive cocci in blood cultures, a panel of FISH probes was developed and applied to 428 samples. Identification succeeded with high sensitivity and specificity within 3 hours. Microbial diagnosis of infectios endocarditis (IE) is challenging, as many cases remain culture- negative. In this study, FISH succeeded in identification of microorganisms in 26 of 54 heart valve samples from suspected endocarditis patients. 5 cases were culture-negative and included fastidious organisms as T. whipplei and B. quintana. Complex bacterial biofilm structures were visualized that could easily be distinguished from contamination. Human intestinal spirochaetosis (HIS) is caused by spirochaetes of the genus Brachyspira and is associated with chronic gastrointestinal symptoms. Many cases may be missed, as culture requires selective media and incubation up to 4 weeks. In this study, a Brachyspira-specific FISH probe was developed and evaluated. In 5 cases, Brachyspira spp. were successfully visualized and identified in intestinal biopsies. In conclusion, FISH can potentially be used in addition to routine procedures especially for diagnosis of IE and HIS. Further prospective studies are needed to investigate the benefit for patient management and prognosis.