Classification of common variable immunodeficiencies using flow cytometry and memory B-cell functionality assay

Abstract

Background: The population of patients with common variable immunodeficiency (CVID) comprises a heterogeneous group of patients with different causes of ypogammaglobulinemia predisposing to recurrent infections, higher incidence of autoimmunity, and malignancy. Although memory B cells (memBcs) are key players in humoral defense and their numbers are commonly reduced in these patients, their functionality is not part of any current classification. Objective: We established and validated a memBc enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay that reveals the capacity of memBcs to develop into antibody-secreting cells and present an idea for a new classification based on this functional capacity. Methods: The memBc ELISpot assay combined with flow cytometry was applied to patients with confirmed CVID in comparison with age-matched healthy control subjects. Results: Ex vivo frequency of IgG-, IgM-, and IgA-secreting plasmablasts was significantly diminished by 27.2-, 2.4-, and 23.3-fold, respectively, compared with that seen in healthy control subjects. Moreover, in vitro differentiation of memBcs into antibody-secreting cells was 6.1-, 2.6-, and 3.7-fold significantly reduced for IgG-, IgM-, and IgA-secreting cells, respectively. Proliferation of memBcs correlates inversely to immunoglobulin-secreting capacity, suggesting compensatory hyperproliferation. Furthermore, patients with no serum IgA can still have a detectable IgA ELISpot assay result in vitro. Most importantly, the large heterogeneity of memBc function in patients with CVID homogenously grouped by means of fluorescence-activated cell sorting allowed additional subclassification based on memBc/plasmablast function. Conclusion: These data suggest almost normal memBc/immunoglobulin-secreting plasmablast functionality in some patients if sufficient stimulatory signals are delivered, which might open opportunities for new therapeutic approaches.

Einleitung: Patienten mit kombiniertem variablen Immundefekt (Common Variable Immunodeficiency, CVID) gehören zu einer sehr heterogenen Gruppe mit verschiedenen Ursachen für Hypogammaglobulinämie, welche rezidivierende Infekte, eine höhere Inzidenz an Autoimmunität und Malignität begünstigt. Obwohl Gedächtnis-B-Zellen (memBc) eine Schlüsselrolle in der humoralen Abwehr einnehmen und sie bei diesen Patienten häufig erniedrigte Zellzahlen aufweisen, sind sie kein Bestandteil derzeitiger Klassifikationen. Zielsetzung: Wir etablierten und validierten einen Enzym-gekoppelten Immunadsorptions-Spot-Test (enzyme-linked immunosorbent spot, ELISpot) für memBc, welcher deren Kapazität sich in Antikörper-sekretierende Zellen zu differenzieren zeigt und präsentieren eine Idee für eine neue Klassifikation auf der Basis dieses funktionalen Tests. Methoden: Der memBc ELISpot wurde in Kombination mit Durchflußzytometrie an Patienten mit bestätigtem CVID angewandt im Vergleich zu altersnormierten gesunden Probanden. Ergebnisse: Die ex vivo Häufigkeit von IgG-, IgM-, und IgA-sekretierenden Plasmablasten war im Vergleich zu den gesunden Probanden je um das 27.2-, 2.4-, und 23.3-fache signifikant erniedrig. Darüber hinaus war die in vitro Differenzierung von memBc zu Antikörper-sekretierenden Zellen um je das 6.1-, 2.6-, and 3.7-fache für die Isotypen IgG, IgM und IgA reduziert. Die Proliferation von memBc korreliert invers zur Kapazität der Antikörpersekretion, welches eine kompensatorische Hyperproliferation andeutet. Außerdem können Patienten ohne Serum-IgA Titer dennoch messbare IgA ELISpot Antworten in vitro generieren. Vor allem aber, erlaubt die große Heterogenität der memBc Funktion der CVID Patienten, welche durchflußzytometrisch homogen gruppiert waren, eine weitere Subklassifikation auf der Basis der memBc/Plasmablasten Funktion. Fazit: Diese Daten zeigen fast normale Funktionalität der memBc/Antikörper-sekretierenden Plasmablasten in manchen Patienten, wenn suffiziente stimulatorische Signale gegeben werden, welches Gelegenheiten für neue therapeutische Herangehensweisen ermöglichen kann.