Characterization of cytokine responses and memory cell subsets using a multicolor flowcytometry-based approach

Abstract

The recent advances in flowcytometry have come hand-in-hand with an improved knowledge of the immune system, and with practical and clinical benefits. Given the need to answer immunological and clinically relevant questions, a flowcytometry-based approach that focuses on the assessment of cytokine secretion and memory markers in different settings was established. The Epstein-Barr Virus (EBV)-specific T cell memory analysis revealed the existence of six subsets at distinct differentiation stages. The memory T cell profile of a protective immune-response against a chronic infection was delineated, providing a basis for analyzing T cell responses in EBV-associated diseases. The enhanced frequencies of multifunctional and cytotoxic EBV- specific T cells found in bone marrow (BM) are of great interest for adoptive immunotherapy. A similar analysis was performed to characterize the Cytomegalovirus (CMV)-specific T cell-memory profile, and remarkable differences were observed relatively to the EBV-memory repertoire. The results uncovered that BM CMV-specific CD4+ T cells have higher proliferative and multi-cytokine producing capacities than peripheral blood (PB) cells reinforcing BM as an interesting source to generate T cells for adoptive therapy. To elucidate the role of Toll like receptors (TLRs) in controlling the Herpes Simplex virus-1 (HSV-1), TLR function in natural killer (NK) cells of seropositive subjects with and without herpes labialis (HL) was analyzed. We found that TLR3-hyporesponsiveness of NK cells is associated with susceptibility to recurrent HL, suggesting stimulation of TLR3 as a potential strategy to prevent symptomatic HSV-1 reactivation. T cell receptor (TCR) repertoire investigation is essential for the detection of clonal T cell expansions in physiologic and pathologic conditions. To address the impact of memory pool changes on TCR-Vβ repertoire, we characterized and quantified TCR repertoires during latent CMV infection within various T cell differentiation subsets, providing a reference for elucidating subset-specific TCR repertoires in pathologic conditions. Adiponectin (APN) possesses immunoinhibitory effects, but little is known about its influence on T cells. We have shown that T cells express Adiponectin-Receptors and upregulate them upon TCR- stimulation and that APN diminishes antigen-specific T cell expansion and cytokine production. Our findings suggest that APN, a cytokine abundant in human plasma, may exert an important role in systemic T cell regulation, not restricted to the interplay between immune-cells. As a whole, the work presented herein reveals multicolor flowcytometry as a powerful tool for understanding the role of immune function in different clinical settings.

Die neuesten Fortschritte in der Durchflusszytometrie gehen Hand in Hand nicht nur mit einem besseren theoretischen Verstaendnis des Immunsystems, sondern auch mit praktischem und klinischem Nutzen. Aufgrund der Notwendigkeit, immunologisch und klinisch relevante unbeantwortete Fragen zu klaeren, haben wir in verschiedenen Situationen einen durchflusszytometrischen Ansatz etabliert, der auf der Messung von Zytokinsekretion basiert. Bei der Analyse von EBV-spezifischen Gedaechtnis-T-Zellen, haben wir die Existenz von sechs verschiedenen Untergruppen mit spezifischen Differenzierungsstadien nachgewiesen. In dieser Studie beschreiben wir das Gedaechtnis-T-Zell-Profil einer protektiven Immunantwort gegen eine chronische Infektion als Basis fuer die Analyse von T-Zell-Antworten in EBV-assoziierten Erkrankungen. Desweiteren sind die Erkenntnisse ueber höhere Frequenzen von multifunktionalen und zytotoxischen EBV-spezifischen T-Zellen im Knochenmark von großem Interesse fuer adoptive Immuntherapie. Eine aehnliche Analyse wurde durchgefuehrt, um CMV-spezifische Gedaechtnis-T-Zellen zu charakterisieren. Dabei wurden deutliche Unterschiede zum EBV-Gedaechtnis-Repertoir festgestellt. Unsere Analysen zeigen ausserdem, dass CMV-spezifische CD4+ T-Zellen aus dem Knochenmark eine hoeheres Wachstumskapazitaet haben und mehr verschiedene Zytokine produzieren als entsprechende Zellen im peripheren Blut. Dies bestaetigt die Wichtigkeit des Knochenmarks als interessante Quelle um T-Zellen fuer die adoptive Therapie zu gewinnen. Um die Bedeutung von TLR bei der Kontrolle von HSV-1 besser zu verstehen, analysierten wir den TLR- Antworten von NK-Zellen in seropositiven Patienten. Wir haben gesehen, dass eine verminderte TLR3-Antwort der NK-Zellen wiederkehrendem HL assoziiert ist. Unsere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Stimulierung von TLR3 eine potentielle Strategie zur Verhinderung von symptomatischen HSV-1-Reaktivierungen sein koennte. Mittels TZR Repertoire Analyse werden klonale T cell Expansionen nachgewiesen, das wird normalerweise an Gesamt-T-Zellen durchgeführt.. Um beurteilen zu können, inwieweit sich das TZR Repertoire in T Zell-Gedächtniszellen ändert, quantifizierten wir das TZR Repertoire in CMV–spezifischen T-Zell-Subpopulationen. Unsere Analyse kann als Referenz für zukünftige Studien dienen. Adiponectin (APN) besitzt immuninhibitorische Effekte in verschiedenen Krankheitsmodellen, dennoch ist wenig ueber dessen Einfluss auf T-Zellen bekannt. Wir konnten nachweisen, dass T-Zellen Adiponectinrezeptoren exprimieren und nach TCR-Stimulierung hochregulieren. Ausserdem zeigten wir, dass APN die antigen-spezifische T -Zell-Expansion und Zytokinproduktion vermindert. Da APN im menschlichen Plasma in grossen Mengen vorhanden ist, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass dieses Zytokin eine wichtige Rolle bei der systemischen T-Zell- Regulierung spielt, die nicht auf den direkten Kontakt zwischen Immunzellen beschraenkt ist. Unsere Arbeit bestaetigt die Wichtigkeit, Zytokinantworten in verschieden Zellpopulation mittels Vielfarben-Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese ist ein wichtiges Werkzeug fuer das bessere Verstaendnis der Rolle des Immunsystems in verschiedene klinischen Situationen.