Untersuchungen zur Optimierung pharmakologischer Studien an hepatischen Zellen in 2D- und 3D-Kulturen

Abstract

Die Leber ist ein zentrales Organ der Biotransformation und Detoxifizierung endogener und xenobiotischer Substanzen und spielt eine wichtige Rolle in der pharmakologischen und toxikologischen Forschung. Primäre humane Hepatozyten representieren ein prädiktives in vitroModell des leberspezifischen Metabolismus, allerdings hat die Verwendung dieser Zellen den Nachteil der limitierten Verfügbarkeit und einer eingeschränkten Lebensdauer der Zellen. Die Verwendung hepatischer Zelllinien und die methodische Optimierung der Kulturbedingungen durch die Verwendung von 3D-Kultur technologien gilt als aussichtsreiche Methode, um diese Einschränkungen zu adressieren. Das Ziel dieses Promotionsvorhabens war die Optimierung eines 3D-Bioreaktor- Kulturmodells für in vitro Studien zum Arzneistoffmetabolismus unter Verwendung von primären humanen Hepatozyten. Hierzu wurden insbesondere der Verzicht der Supplementierung mit fötalem Kälberserum im Kulturmedium und die Verwendung der 3D-Bioreaktorkultur für pharmakologische Studien untersucht. Ferner wurde die hepatische Zelllinie HepaRG als ein möglicher Ersatz für primäre humane Hepatozyten charakterisiert. Basierend auf der Bestimmung metabolischer Eigenschaften unter Einbeziehung der Aktivität humanrelevanter Cytochrom P450 (CYP)-Enzyme und durch Studien zur Genexpression konnte gezeigt werden, dass miniaturisierte Bioreaktorvarianten die Versorgung von primären humanen Hepatozyten unter serumfreien Bedingungen mit einer verlängerten Stabilität wesentlicher humanrelevanter CYP-Enzyme begünstigen.Immunhistochemische Färbungen von Zellmaterial aus Bioreaktoren zeigten eine Reorganisation parenchymaler und nicht-parenchymaler Zellen zu lebergewebeartigen Strukturen.Studien zum Arzneistoffmetabolismus und zu Wirkstoffaufnahmeraten anHepaRG Zellen und primären humanen Hepatozytenweisen darauf hin, das die HepaRG-Zelllinie optional als Alternative für primäre humane Hepatozyten verwendet werden könnte. Somit bietet der miniaturisierte Bioreaktor ein geeignetes Instrument für pharmakologische Untersuchungen unter definierten und kontrollierten Bedingungen in Langzeitstudien mit primären humanen Hepatozyten oder geeigneten Zelllinien wie der Zelllinie HepaRG.

The liver is a central organ for biotransformation and detoxification of endogenous and xenobiotic substances and plays a major role in research on pharmacokinetics and drug toxicity.Primaryhumanhepatocytes (pHH) represent a predictive in vitro model for liver specific metabolism, but the use of these cells has the disadvantage of a limited availability and lifetime. To overcome these limitations, the use of hepatic cell lines and approaches for improvement of culture conditions using 3D culture technologies have been proposed. The aim of this dissertation was the optimisation of a 3D bioreactor culture model for in vitro studies on drug metabolism using pHH. Specifically, the possible omission of foetal calf serum supplement in the culture medium and the use of the bioreactor system for pharmacological studies were investigated. In addition the hepatic cell line HepaRG was characterized as a possible surrogate forpHH. Based on the determination of metabolic performances, including cytochrome P450 (CYP) enzyme activities and gene expression studies, miniaturized bioreactor variants were shown to promote the maintenance of pHH under serum free conditions with a prolonged stability of major human relevant CYP enzymes. Immune histochemical staining of cell material from bioreactors showed a reorganisation of parenchymal and non- parenchymal cells to liver tissue like structures. Studies on drug metabolism and clearence rates using the HepaRG cell line showed that metabolic performances were comparable to those ofpHH, indicating that this cell line has the potential to be used as analternative to pHH. Thus the miniaturized bioreactor provides a suitable tool for pharmacological assays under well- defined and controlled conditions in long-term studies with pHH or suitable cell lines, such as the HepaRG cell line.