Peptid-Mikroarray-basierte serologische Diagnose und Typisierung von Toxoplasma gondii-Infektionen bei Menschen und Katzen in Deutschland

Abstract

Mehrere Studien berichten über Hinweise, dass schwerwiegende Infektionsverläufe bei Menschen und Tieren mit bestimmten Genotypen und klonalen Linien von T. gondii in Verbindung stehen. Es ist daher wichtig, Kenntnisse über die Verbreitung unterschiedlicher Genotypen und Linien von T. gondii zu erlangen. Mithilfe dieser Kenntnisse könnten Infektionsgefährdungen für Menschen und Tiere besser abgeschätzt werden. Hinweise auf die Genotypen von T. gondii, mit denen Menschen oder Tiere infiziert sind, könnten in Zukunft frühzeitig Rückschlüsse auf den weiteren Infektionsverlauf liefern und gegebenenfalls eine Optimierung der Behandlung gestatten. Die Ergebnisse der in dieser Dissertation zusammengefassten Studien zeigen, dass Peptid- Mikroarrays geeignete Testsysteme für die serologische Diagnose und Typisierung von T. gondii-Infektionen bei Menschen und Katzen darstellen. Mit Hilfe von Peptid-Mikroarrays und Seren experimentell und natürlich infizierter Katzen konnte erstmals belegt werden, dass Katzen in der Lage sind, eine typspezifische IgGAntwort gegen T. gondii der klonalen Typen I, II, und III zu entwickeln. Nach Validierung wurden 27 Peptide selektiert, die für eine Serotypisierung der klonalen T. gondii-Infektionen verwendet wurden. Aufgrund früherer Studien konnte davon ausgegangen werden, dass die meisten Zwischenwirte in Deutschland gegenüber T. gondii des klonalen Typs II exponiert sind. Jedoch gab es keine Information zum Vorkommen unterschiedlicher T. gondii-Genotypen bei Menschen und nur im begrenzten Umfang Daten zum Vorkommen unterschiedlicher T. gondii-Typen bei Hauskatzen in Deutschland. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass positive Typ-II-spezifische Peptidreaktionen bei serologisch positiven Menschen und Katzen signifikant überrepräsentiert sind. Die Reaktionen gegen Typ-II-spezifische Peptide waren signifikant stärker als die Reaktionen gegen Peptide anderer Spezifitäten. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die meisten T. gondii-Infektionen bei Menschen und Hauskatzen in Deutschland durch T. gondii des klonalen Typs II verursacht werden. Die Studien bestätigen die Resultate vorheriger Arbeiten, in denen hauptsächlich Typ II bei den von Katzen in Deutschland ausgeschiedenen T. gondii-Oozysten nachgewiesen wurde. Da sporulierte Oozysten von T. gondii eine der wichtigsten Infektionsquellen für Zwischenwirte darstellen, war zu erwarten, dass es hinsichtlich der bei Katzen und Menschen beobachteten Serotypisierungs-Resultate keine wesentlichen Unterschiede geben sollte. Die hier durchgeführten Arbeiten repräsentieren eine erste Serotypisierung von T. gondii- Infektionen bei Menschen in Deutschland und eine erste bei Katzen weltweit mit Hilfe von Peptid-Mikroarrays. Allerdings zeigen die Ergebnisse, dass weitere gut validierte typspezifische Peptide erforderlich sind, um eine spezifischere Serotypisierung zu erreichen. Eine weitere Validierung mit einer größeren Zahl von gut definierten Seren könnte das Identifizieren und die Selektion polymorpher Peptide für die Serotypisierung erleichtern. Die in dieser Dissertation zusammengefassten Studien (Publikation 2, Manuskript 3) zeigen die Anwendbarkeit von bioinformatischen Verfahren wie „propensity scale“-Algorithmen und die ABCpred-Methode zur Vorhersage von linearen Epitopen in T. gondii-Antigenen. Mit der „propensity scale“-Methode wurden neun polymorphe Peptide ausgewählt, die als Teil von einem Peptid-Panel für T. gondii Serotypisierung eingesetzt werden könnten. Mit Hilfe von ABCpred konnten bioinformatisch insgesamt acht neue lineare Epitope vorhergesagt werden, die sich künftig auch als Teil eines diagnostischen Peptid-Panels einsetzen lassen. Insgesamt wurden in dieser Studie (Publikation 2) zehn Peptide (acht ABCpredvorhergesagte und zwei aus der Literatur) mit diagnostischem Potential identifiziert. Durch den Einsatz dieser Peptide im Peptid-Mikroarray zur serologischen Diagnose der humanen Toxoplasmose wurde eine diagnostische Sensitivität von 69% und Spezifität von 84% erreicht. Diese diagnostischen Parameter sind akzeptabel, aber nicht optimal. Um bessere diagnostische Eigenschaften des Testsystems erreichen zu können, ist es notwendig, das Peptid-Panel zu optimieren und nach weiteren Peptiden mit diagnostischem Potential zu forschen. Die Arbeit zeigt, dass die Anwendung bioinformatischer Programme zur Epitopvorhersage zusammen mit Peptid-Mikroarrays geeignete Laborwerkzeuge darstellen, mit denen T. gondii- Epitope identifiziert werden können, die sich zur serologischen Diagnose oder Typisierung eignen. Aus Peptiden, die diese Epitope enthalten, wurden Mikroarray-Tests entwickelt und zur serologischen Typisierung von T. gondii- Infektionen bei Menschen und Katzen eingesetzt.

Several studies reported that certain T. gondii genotypes and clonal lineages correlate with severe toxoplasmosis in mice and humans. Therefore it may be important to have information on the prevalence of different T. gondii genotypes in humans and animals. In future, this information may help to better estimate the risk of infection for humans and animals. Information on the genotype of T. gondii an individual human or animal is infected may allow to conclude on the further development of disease and to optimise treatment. The results of studies summarized in this cumulative thesis demonstrate that a peptidemicroarray assay can be used for diagnosis of T. gondii infection and to detect T. gondii clonal type-specific antibody responses in seropositive humans and cats. With a peptide microarray and sera from experimentally- infected and naturally-infected cats it was shown for the first time that cats are able to mount a clonal type-specific IgG antibody response against T. gondii. After validation, 27 peptides were selected which were suitable for T. gondii serotyping in cats. Previous work suggested that individuals in the study area were mainly exposed to T. gondii clonal type II. However, there was no information, which clonal type of T. gondii is most prevalent in infected humans, and there was only limited data about the distribution of T. gondii types in cats in Germany. The results of this study demonstrate that positive peptide reactions presenting clonal type II were statistically significantly overrepresented in the tested human and cat population. The intensity, by which type II peptides were recognized, was also significantly higher than the intensity with which peptides of other specificities were detected. The results suggest that most T. gondii infections in humans and cats were caused by T. gondii clonal type II in Germany and confirmed previous findings reporting a pre-dominance of type II in oocysts shed by cats in Germany. Since sporulated T. gondii oocysts present one of the most important sources of infection for intermediate hosts, it was expected that there were no major differences in serotyping results between those for cats and humans. These are the first peptide microarray-based serotyping studies on T. gondii infections in humans in Germany and the first in cats worldwide. However, further carefully validated typespecific peptides are necessary to optimize the specificity of serotyping. Further validation with a larger number of well- characterized sera may help to identify and select further polymorphic peptides with a diagnostic potential. The results summarized in the present thesis (publication 2, manuscript 3) demonstrate that propensity scale-based and ABCpred bioinformatic methods are suitable for the in-silico prediction of linear epitopes on T. gondii antigens. The propensity scale method identified nine polymorphic epitopes that could be used as part of a peptide panel for T. gondii serotyping in cats. Using ABCpred, eight novel linear epitopes were predicted, which could be included in a larger peptide array for diagnosis. A total of ten peptides with diagnostic potential (eight ABCpred-predicted and two taken from the literature) were identified in this study (publication 2). The use of these peptides in a peptide-array revealed an overall diagnostic sensitivity of 69% and a diagnostic specificity of 84%. These diagnostic parameters are acceptable, but not optimal. To achieve better diagnostic properties, it is necessary to identify further epitopes with diagnostic potential to extend the peptide panel. In conclusion, this study demonstrates that bioinformatic programs in combination with peptide-microarray represent a powerful tool for the prediction and analysis of T. gondii linear epitopes suitable for serotyping or diagnosis. Based on peptides containing these epitopes peptide microarray tests were developed in the present thesis and applied or serological typing of T. gondii infections in humans and cats.