Die Bedeutung von Rep78 und ICP8 bei der Initiation der DNA-Replikation des Adeno-assoziierten Virus durch Herpes Simplex Virus

Abstract

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind als Gentherapie-Vektoren in klinischen Studien zunehmend erfolgreich. Mit der Aussicht auf eine breite klinische Anwendung stellt die Optimierung der AAV-Vektorproduktion eine besondere Herausforderung dar. Für die effiziente Replikation von Wildtyp-AAV und der davon abgeleiteten Vektoren wird Herpes Simplex Virus (HSV) als wichtigstes Helfervirus eingesetzt. Durch die AAV-ssDNA-abhängige Interaktion des multifunktionellen AAV-Proteins Rep78 mit dem HSV-Einzelstrang-DNA-bindenden Protein ICP8 wird die HSV-vermittelte AAV-DNA-Replikation initiiert. In dieser Arbeit sollten die Rep78-Domänen charakterisiert werden, die die Bildung des ternären Komplexes aus Rep78, ICP8 und dem AAV-ssDNA-Genom vermitteln. Eine systematische Mutationsanalyse führte zur Identifizierung der Rep78-DNA- Bindungsdomäne als essentielles Interaktionselement. Der Austausch einzelner konservierter Aminosäuren im N-Terminus von Rep78, die als Kontaktpunkte mit der Rep-binding site auf dem AAV-Genom beschrieben waren, resultierte im Verlust der AAV-ssDNA-stimulierten Interaktion in vitro und der Aufhebung der nukleären Kolokalisation beider Proteine in vivo. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass diese Rep78-Punktmutationen zu einem Verlust der AAV-DNA- Replikationskompetenz führen. Die Ergebnisse lassen sich am besten über eine indirekte Interaktion von AAV-Rep78 und HSV-ICP8 auf dem AAV-Genom erklären, wodurch die nächsten Schritte der AAV-DNA-Replikation eingeleitet werden. Die Rep78-vermittelte Rekrutierung von ICP8 und darüber weiterer HSV- Replikationsfaktoren an das AAV-Genom unterstreicht die Rolle von Rep78 als Replikationsinitiator bzw. AAV origin-binding Protein. Die vorliegenden Ergebnisse erweitern das Verständnis der molekularen Mechanismen bei der besonderen Helfervirus-abhängigen AAV-DNA-Replikation. Sie bilden die Grundlage für aufbauende Untersuchungen wie die Analyse der ICP8-Domänen und weiterer an der AAV-Replikation beteiligter HSV- und zellulärer Replikationsfaktoren. Dies dient auch der Weiterentwicklung der bereits erfolgreich eingesetzten HSV-basierten AAV-Vektorproduktion, um eine breite und sichere Verwendung von AAV in der klinischen Gentherapie zu gewährleisten.

Adeno-associated viruses (AAV) have been shown to be increasingly successful as vectors in gene therapy studies. In the face of a wider clinical application in the future, the improvement of AAV vector production is becoming a particular challenge. For an efficient replication of wildtype AAV and AAV vectors, Herpes Simplex Virus (HSV) is being used as the most important helper virus. AAV DNA replication supported by HSV is initiated by the AAV ssDNA-dependent interaction of the AAV multifunctional protein Rep78 with the HSV ssDNA-binding protein ICP8. This study characterizes the domains of Rep78 that are needed for complex formation of Rep78, ICP8, and the AAV ssDNA genome. A mutation analysis could identify the DNA binding domain as the essential element of Rep78 for the interaction with ICP8. Exchange of particular conserved amino acids within the N-terminus of Rep78 known to be contact points with the rep binding site on the AAV genome was followed by the loss of in vitro interaction and in vivo co-localization of the proteins. The same point mutations in Rep78 led to AAV DNA replication deficiency. An indirect, DNA-mediated interaction of AAV Rep78 and HSV ICP8 on the AAV genome might best explain these results. This interaction precedes the next steps in the HSV-dependent AAV DNA replication and might be supported by the recruiting of ICP8 through the AAV protein. Thus Rep78 can be regarded as AAV origin- binding protein. The investigation of the DNA-mediated interaction between ICP8 and Rep78 might help to further understand the molecular mechanisms of helper virus-dependent AAV replication. Future projects such as the examination of ICP8 domains or other viral or cellular replication proteins can be based on the actual findings. This is also important for the improvement of HSV-based production of AAV vectors and their safe application in clinical gene therapy trials.