The bacterial ribosome: testing a new concept for translational initiation. - APPENDIX: Solving preparation problems for tmRNA•70S complexes

Abstract

Protein synthesis encompasses three universal steps initiation, elongation and termination. The standard model for initiation is that the small 30S subunit finds the initiation signals on an mRNA with the help of three monomeric factors IF1, IF2 and IF3. IF1 and IF3 are believed to bind exclusively to the 30S subunit rather than to 70S ribosomes. This 30S-binding mode as standard initiation type cannot easily be reconciled with a number of observations. We developed a hypothesis according to which these inconsistencies are resolved, namely the 70S-scanning mode saying that a 70S does not dissociate after the translation of a cistron, but is able to scan in both directions on the mRNA checking for another initiation signal of a downstream cistron. In this thesis we present in vitro evidence that support this hypothesis: 1\. First evidence that beyond the standard 30S initiation mode another mode might exist was provided with a fully synthetic in vitro system for the translation of GFP. We could demonstrate that the optimal effect for GFP synthesis was obtained with tightly coupled 70S ribosomes rather then with isolated subunits, IF3 was essential and IF1 important, the latter one stimulated GFP synthesis by more than 3-fold. 2\. We constructed a bicistronic mRNA coding for Renilla and Firefly luciferase, respectively, without any secondary structure in the intercistronic region. Blocking translation of the first via antisense-DNA or binding antisense-DNA to the intercistronic region blocked seriously the translation of the second one, whereas the monocistronic Firefly mRNA was hardly effected demonstrating that a 70S leaving the first cistron is involved in the translation of the second one. 3\. Next we synthesized a model mRNA containing Phe-stop codons and downstream Met-Lys codons with a Shine-Dalgarno sequence before. With this mRNA we could construct a post-termination complex carrying a deacylated tRNAPhe in the P site with a stop codon at the A site. Adding fMet-tRNA triggered a movement towards the downstream AUG. This result was obtained not only with re-associated 70S ribosomes but also with crosslinked 70S, which could not anymore dissociate. This result proves the 70S can scan downwards from the UUC codon to the next cistron start site. 4\. We overexpressed and purified five factors and proteins and together with the factors, which were available in the lab a complete analysis of the components essential for scanning could be performed. Surprising results were obtained: (i) fMet-tRNA alone could provoke scanning of the 70S down to the initiation site. (ii) Under more physiological conditions in the presence of all factors the initiation factors were essential and the elongation factors and RRF improved the scanning effect. These results establish a new initiation mode for bacterial translation, a mode that we termed 70S-scanning mode.

Die zelluläre Proteinsynthese besteht aus drei universellen Schritten: Initiation, Elongation und Termination. Das Standardmodell der bakteriellen Initiation beschreibt die kleine ribosomale Untereinheit, die mit der Hilfe der monomeren Faktoren IF1, IF2 und IF3 Initiationssignale findet und die Translation einleitet. Diese Initiationsfaktoren sind als 30S spezifische Proteine bekannt, die nicht an 70S Ribosomen binden. Es ist schwierig diese 30S-Initiation mit einer Anzahl von Beobachtungen in Einklang zu bringen. Daher haben wir eine Hypothese entwickelt, die es erlaubt diese Unstimmigkeiten zu klären. Wir schlagen ein Modell vor, das davon ausgeht, dass 70S Ribosomen nach der Translation eines Cistrons nicht Dissoziieren und die mRNA verlassen, sondern in der Lage sind in beide Richtungen - upstream und downstream des Stoppkodons – zu scannen bis sie ein neues Initiationssignal erreichen und dort erneut Proteinsynthese einleiten. Diesen Modus nennen wir 70S-Scanning-Initiation. In dieser Doktorarbeit präsentieren wir mehrere Indizien aus in vitro Versuchen, die diese Hypothese stützen: 1\. Den erste Anhaltspunkt, das jenseits der 30S-Modus eine andere Form der Initiation existiert, konnten wir mit einem synthetischen in vitro System für die Translation von GFP erbringen. Wir konnten zeigen, dass optimale GFP Synthese nur mit 70S Ribosomen, nicht aber mit Untereinheiten, möglich war. IF1 war für diesen Vorgang wichtig (stimulierte GFP-Synthese 3x) und IF3 sogar essentiell. 2\. Des Weiteren konstruierten wir eine bi-cistronische mRNA, die sowohl für Renilla- als auch für Firefly-Luziferase kodiert und keine Sekundärstruktur in der intercistronischen Region (IR) besitzt. Durch die Blockade des ersten Cistrons oder der IR durch Bindung von “anti-sense DNA” konnten wir die Translation des zweiten Cistron dramatisch reduzieren. Dies war mit einer monocistronischen mRNA nicht möglich und wies darauf hin, dass 70S Ribosomen, die für die Translation des ersten Cistrons verantwortlich sind, auch an der Translation des darauf folgenden, zweiten Cistrons beteiligt sind. 3\. Ferner synthetisierten wir eine mRNA, die im ersten Cistron ein Kodon für Phe als auch ein Stoppkodon besaß und downstream im zweiten Cistron ein Kodon für Met und Lys, mit einer vorangehenden Shine-Dalgarno-Sequenz. Mit dieser mRNA waren wir in der Lage Postterminationskomplexe herzustellen, die eine deacylierte tRNAPhe in der P-Stelle besaßen und in der A-Stelle ein Stoppkodon aufwiesen. Durch die Zugabe von fMet-tRNA waren wir in der Lage eine Bewegung des Ribosomens zum „downstream“ AUG auszulösen. Dieses Ergebnis konnten wir nicht nur mit reassoziierten 70S sondern auch mit chemisch modifizierten Ribosomen, die nicht dissoziieren können, erzielen. Dieses Resultat beweist, dass 70S in der Lage sind nach der Termination eines Cistrons zum Startkodon des nächsten zu scannen. 4\. Letztendlich überexpremierten und reinigten wir fünf Proteine, die wir mit den in der Gruppe bereits vorhandenen Faktoren auf Ihrer Funktion im 70S-Scanning-Modus testeten. Einige überraschende Ergebnisse wurden erbracht: (i) fMet-tRNA ist in der Lage das Scannen eines 70S Ribosomens auszulösen (ii) unter physiologischen Bedingungen, d.h. in der Präsenz aller an der Proteinsynthese beteiligten Faktoren, scheinen die Initiationsfaktoren essentiell für das 70S- scannen zu sein. Darüber hinaus haben wir auch eine wichtige Funktion von Elongationsfaktoren und RRF in diesem neuen Initiationsmodus nachweisen können. Die Resultate führten zu Aufklärung eines neuen Initiationsmechanismus in Bakterien, diesen Mechanismus nennen wir 70S-Scanning-Initiation.