Hemmung des Adhäsionsrezeptors L-Selektin - Charakterisierung inhibitorischer Oligosaccharide und Glykomimetika

Abstract

L-Selektin vermittelt zusammen mit seinen endothelialen Liganden das Rollen von Leukozyten auf dem Gefäßendothel und leitet hiermit den ersten Schritt einer Adhäsionskaskade ein, die zum Auswandern der Leukozyten in das perivaskuläre Gewebe führt. L-Selektin ist daher einerseits essentiell für die physiologische Immunabwehr. Andererseits ist L-Selektin an pathologischen Entzündungsreaktionen, beispielsweise an der Transplantatabstoßung oder an Autoimmunkrankheiten beteiligt. Es stellt somit eine Zielstruktur für antiinflammatorische Wirkstoffe dar, die durch Blockade von L-Selektin die Rekrutierung von Leukozyten in entzündetes Gewebe hemmen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Hemmung der Bindung von L-Selektin an seine Liganden durch synthetische multivalente Liganden auf der Basis von Sialyl Lewis x, Glykomimetika und rekombinanten Glykoproteinen zu untersuchen. Diese Untersuchungen sollten auf der Ebene einzelner Moleküle und auf der Ebene intakter Zellen unter Flussbedingungen erfolgen und somit der Scherstressabhängigkeit der Bindungsfunktion von L-Selektin Rechnung tragen. Für die Untersuchung unterschiedlicher Inhibitoren wurde ein standardisiertes Testsystem entwickelt, bei dem die Bindung von rekombinantem divalenten L -Selektin-IgG an den synthetischen Liganden SiaLex-PAA-sTyr mittels Oberflächenplasmonenresonanz gemessen wurde. Weiterhin wurde ein Flusskammer- Assay für die Untersuchungen von Inhibitoren adaptiert, bei dem das Rollen und die Adhäsion transfizierter NALM-6-Zellen, die L-Selektin auf ihrer Oberfläche exprimieren, an aktivierte HUVECs gemessen wurde. Mit beiden Verfahren wurde die inhibitorische Aktivität von multivalenten Formen von Sialyl Lewis x, Sialyl Lewis a und Tyrosinsulfat kovalent gebunden an den Träger Polyacrylamid im Vergleich zu den monovalenten Formen dieser Liganden gemessen. Die Untersuchungen zeigten, dass Multivalenz zu einer außerordentlichen Steigerung der inhibitorischen Aktivität führt und die Hemmwirkung der multivalenten Inhibitoren mit zunehmendem Scherstress zunimmt. Mit Polyglycerolsulfat-Dendrimeren wurde eine zweite Klasse multivalenter Inhibitoren untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine außerordentlich starke Hemmwirkung dieser multivalenten Inhibitoren. Polyglycerolsulfat-Dendrimere hemmten spezifisch L- und P-Selektin, dagegen nicht die Funktion von E-Selektin. Mit dem Makrolid Efomycin M wurde drittens ein Glykomimetikum auf seine inhibitorische Aktivität untersucht. Efomycin M hemmte selektiv die Bindungsfunktion von L-Selektin, jedoch nicht die von E- und P-Selektin. Diese Untersuchungen zeigten, dass auch monovalente Inhibitoren starke Hemmwirkung besitzen können. Auf der Basis des physiologischen Liganden PSGL-1 und von Hsc70, von dem kürzlich eine Zelloberflächenform, die L-Selektin bindet, beschrieben wurde, wurden zwei potentielle inhibitorische Glykoproteine als Fusionsproteine konstruiert: PSGL-1-IgG als Fusionsprotein des N-Terminus von PSGL-1 mit drei Tyrosinresten und einem O-Glykan, welche das L-Selektin- Bindungsmotiv von PSGL-1 darstellen, und Hsc70-IgG als Fusionsprotein des Sequenzabschnitts 279-299 von Hsc70, welcher Ähnlichkeit zum PSGL-1-Bindungsmotiv aufweist. Die Expression erfolgte in der für Glykosylierung und Sulfatierung geeigneten humanen Zelllinie KG1a. Untersuchungen mittels Oberflächenplasmonenresonanz zeigten eine vergleichbar starke Bindung von PSGL-1-IgG und Hsc70-IgG an L-Selektin. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass die rekombinanten Glykoproteine PSGL-1-IgG und Hsc70-IgG zumindest in ihrer divalenten Form potente Inhibitoren der L-Selektin-Funktion sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass für die Hemmung der Bindungsfunktion von L-Selektin multi- und monovalente Inhibitoren zur Verfügung stehen, die die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien der medikamentösen antiinflammatorischen Therapie eröffnen.

Together with its endothelial ligands, L-selectin mediates leukocyte rolling on vascular endothelium, thereby initiating the first step of an adhesion cascade that leads to transmigration of leukocytes into the perivascular tissue. On the one hand, L-selectin is thus essential for physiological immune defense; on the other hand, it is involved in pathological inflammatory reactions, e.g. transplant rejection or autoimmune diseases. It is therefore a target structure for antiinflammatory agents that inhibit leukocyte recruitment into inflamed tissue by L-selectin blockade. The aim of this study was to examine the inhibition of L-selectin binding to its ligands by synthetic multivalent ligands on the basis of Sialyl Lewis x, glycomimetics and recombinant glycoproteins. These examinations were performed on the level of individual molecules and that of intact cells under flow conditions in order to take into account the shear stress dependence of L-selectin binding. Different inhibitors were examined by developing a standardized test system that measured the binding of recombinant divalent L-selectin-IgG to the synthetic ligand SiaLex-PAA-sTyr by means of surface plasmon resonance. In addition, inhibitors were examined by adapting a flow chamber assay to measure the rolling and adhesion of transfected L-selectin-expressing NALM-6 cells on activated HUVECs. Both procedures were used to measure the inhibitory activity of multivalent forms of Sialyl Lewis x, Sialyl Lewis a and tyrosine sulfate covalently bound to the carrier polyacrylamide in comparison to the monovalent forms of these ligands. The examinations showed that multivalence markedly enhances the inhibitory activity, and increasing shear stress intensifies the inhibitory effect of multivalent inhibitors. Polyglycerol sulfate dendrimers were used to examine a second class of multivalent inhibitors. The results showed a remarkably strong inhibitory effect of these multivalent inhibitors. Polyglycerol sulfate dendrimers were specific for L- and P-selectin but did not inhibit the function of E-selectin. Third, the macrolide efomycine M was used to examine the inhibitory activity of a glycomimetic. Efomycine M was specific for L-selectin but did not inhibit E- or P-selectin binding. These examinations showed that even monovalent inhibitors exert a strong inhibitory effect. Two potential inhibitory glycoproteins were constructed as fusion proteins on the basis of the physiological ligand PSGL-1 and Hsc70, for which an L-selectin-binding cell surface form was recently described: PSGL-1-IgG as the fusion protein of the N-terminus of PSGL-1 with three tyrosine residues and one O-glycan, which represent the L-selectin binding motive of PSGL-1, and Hsc70-IgG as the fusion protein of a sequence segment of Hsc70 of the position 279-299, which shows similarity to the PSGL-1 binding motive. The expression took place in the human cell line KG1a, which is suitable for glycosylation and sulfatation. Examinations utilizing surface plasmon resonance showed a comparably strong binding of PSGL-1-IgG and Hsc70-IgG to L-selectin. This result indicated that the recombinant glycoproteins PSGL-1-IgG and Hsc70-IgG are potent inhibitors of L-selectin function, at least in their divalent form. The results of this study document the availability of multi- and monovalent inhibitors of L-selectin binding that open up prospects for the development of new anti- inflammatory drug strategies.