Untersuchungen zu Vorkommen und Verbreitung von Bacillus cereus in einem Milchtrocknungsbetrieb durch phänotypische und molekularbiologische Charakterisierung der isolierten Stämme

Abstract

Bacillus (B.) cereus ist aufgrund seiner Fähigkeit zur Toxinbildung und der durch Bildung vieler extrazellulärer Enzyme gekennzeichneten Stoffwechselaktivität sowohl als Krankheitserreger als auch als Verderbniserreder zu beurteilen. Das Vorkommen von B. cereus in Milchpulver und z. B. daraus hergestellter Babynahrung ist also unter Gesichtspunkten des vorbeugenden Verbraucherschutzes und der Qualitätssicherung zu betrachten. Ziel der vorgestellten Arbeit war es, durch phänotypische und molekularbiologische Characterisierung der isolierten Stämme Daten zu erheben, die in eine Risikobewertung im Sinne des Verbraucherschutzes und in ein Hygienesicherungskonzept für den Milchtrocknungsbetrieb einfließen können. Hierzu wurden zwischen 1994 und 199 1365 Milchpulverproben und 215 Umfeldproben aus einem großen Milchtrocknungsbetrieb auf B. cereus untersucht. Aus dem Milchpulver wurden 146 (11 % der untersuchten Proben waren B. cereus- haltig) Stämme isoliert. Die phänotipische Charakterisierung beinhaltete konventionelle Bakteriologie und den Nachweis des Toxinbildungsvermögens mit einem kommerziellen Testkit (Tecra-ELISA) und mit einem Zellkulturmodell (VERO-Zellen). Die RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic DNA-PCR) wurde bei ausgewählt Stämmen aus Umfeld und Milchpulver zur molekularbiologischen Charakterisierung angewendet. Mit ihrer Hilfe sollte die Frage beantwortet werden, ob B. cereus als Bestandteil der sog. Hausflora in den Produktionsprozeß gelangt oder über die Anlieferungsmilch. Das Ergebnis von Clusteranalysen hinsichtlich der Ähnlichkeit der beiden Gruppen Milchpulver- und Umfeld-Stämme zeigt, daß es keine signifikante Ähnlichkeit gibt. B. cereus liegt nicht als Bestandteil der Hausflora vor. Der Keim gelangt durch ständigen Eintrag mit der Anlieferungsmilch in das Milchpulver und zwar mit weniger als 1-10 Sporen/ml. Mit dem Tecra-ELISA wurden die B. cereus-Stämme qualitativ und quantitativ auf das Vorhandensein der 45 k Da-Komponente des nicht-hämolytischen Toxins untersucht. Mit dem Zellkulturverfahren wurden die Stämme auf ihre Zytotoxizität getestet, als Indikator diente die Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase). Bei der LDH-Messung wurden 58,4 % der Stämme und im Tecra-ELISA 97,9 % positiv beurteilt. Alle B. cereus-Stämme, die bei der LDH- Messung positiv waren, reagierten auch im ELISA positiv. Die Erörterung des Risikos für das Vorkommen von B. cereus in Milchpulver an hand der erworbenen Daten und der ausgewerteten Literatur führt zur Festlegung eines Grenzwertes von 10 Sporen/g. Dies entspricht dem ermittelten Eintrag von B. cereus über die Rohmilch bei optimaler Herstellungspraxis. Dieser Wert berücksichtigt, daß eine Keimvermehrung während Weiterverarbeitung und Anwendung durch den Verbraucher nicht ausgeschlossen werden kann. Eine moderne Verbraucheraufklärung sollte die durch aerobe Sporenbildner bedingten Risiken vermitteln und deutlich machen, daß für Milchpulver ein Freisein von diesen Keimen nicht garantiert werden kann.

Bacillus (B.) cereus is as well a pathogenic as a spoilage microorganism. This is due to its toxinogenic properties and its highly active metabolism characterized by a formation of many extracellular enzymes. Accordingly the occurrence of B. cereus in milk powder and subsequently produced baby food is to be judged with respect to the protection of consumers and, in adition, with respect to quality assurance. The aim of the work presented was to collect data on phenotypical and molecular characteristics of the organism to perform a risk consideration with regard to consumers protection and to implement a hygiene management system in a milk powder plant. Between 1994 and 1998, 1365 milk powder samples and 215 environmental samples were examined for the presence of B. cereus. From milk powder 146 (11 % of the examined samples contained B. cereus) and from the envionment of the production unit 183 (85 % of the examined samples contained B. cereus) strains were isolated. Phenotypical characterization was performed using conventional bacteriological methods. Toxin formation was examined with a commercial test kit (Tecra-ELISA) and a cytotoxicity assay using VERO-cells. For molecular characterization RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic DNA) was applied. Resuts of RAPD-PCR were used to distinguish between strains from milk powder and from the environment and to clarify wether these strains belong to an inhouse flora or enter the plant via the raw milk. A cluster analysis of both groups of strains did not show similarities between the strains indicating that there is no inhouse flora of B. cereus present. The input of the organsim with raw milk is estimated to be less than 1 spore/ml. According to the result of Tecra-ELISA , a 45 k Da-component of the non- hemolytic toxin was produced by 97.9 % of all strains. Cytotoxicity was measured by release of lactate dehydrogenase (LDH). 58.4 % of the strains were positive in the cytotoxicity assay. All strains positive with this assay were positive with the ELISA as well. Using the data collected, a risk consideration for the ccurrence of B. cereus in milk powder leads to a safty limit of 10 spores/g powder.Theis will not be exceeded in an optimized production process, however, due to the input via raw milk it will not be reduced as well. In addition, the application of this limit takes into consideration a possible multiplication of the organism during subsequent processing and handling by the consumer. The education of consumers should aim on a proper risk communication about aerobic spore formers and also make clear that risk due to this organisms cannot be completely avoided in milk powder.