Untersuchungen zum Farbensehen und Farbenlernen der Honigbiene (Apis mellifera): vom Photorezeptor zum Verhalten

Abstract

Ziel der vorliegenden Dissertation war es, zum Verständnis des visuellen Systems der Honigbiene Apis mellifera beizutragen. Dazu wurde die Expression eines Opsins mit Hilfe der Methode RNA Interferenz (RNAi) spezifisch herunterreguliert. Opsine stellen den Proteinanteil des photorezeptiven visuellen Pigments dar und determinieren die spektrale Empfindlichkeit der Photorezeptoren. Von den drei Rezeptortypen der Retina wurde der für langwelliges Licht empfindliche Photorezeptortyp (L-Rezeptor) als Untersuchungsobjekt gewählt, da er in der aufgabenspezifischen Kodierung von chromatischer und achromatischer Information eine wichtige Rolle spielt. Der Erfolg der Inhibition wurde mit molekularbiologischen und elektrophysiologischen Methoden untersucht. Zusätzlich wurde ein verhaltensbiologischer Test entwickelt, um das Farbensehen und –lernen in fixierten Tieren untersuchen zu können. Die Evaluation der Wirkung von RNAi auf die mRNA-Menge des für langwelliges Licht empfindlichen Opsins (LW-Opsin) mit Real Time PCR ergab, dass eine Hemmung um bis zu 60% erreicht werden konnte. Die Wirkung war zeitlich auf einige Stunden und lokal auf die injizierte Retina begrenzt. Überdies wurde eine Mindestmenge an doppelsträngiger RNA benötigt, damit eine Hemmung detektiert werden konnte. Der Gehalt an LW-Opsin Protein wurde mit Hilfe eines für das LW-Opsin der Hummel entwickelten Antiköpers durch SDS-PAGE und Western Blot quantifiziert. Die Untersuchung von unbehandelten Tieren offenbarte eine natürliche Schwankung der LW-Opsin Proteinmenge im Tagesverlauf, mit einem Maximum acht Stunden nach Beginn der Photoperiode und einen folgenden Abfall um fast 50%. Zwölf Stunden nach der Injektion von spezifischer doppelsträngiger RNA war die Proteinmenge relativ zu Kontrolltieren um ca. 25% reduziert wenn die Injektion am Morgen stattfand. Eine Injektion am Abend rief dagegen keine statistisch signifikante Wirkung hervor, ebenso war in späteren Messungen keine Reduktion des Proteins messbar. In der Messung retinaler Summenpotentiale (Elektroretinogramme, ERGs) wirkte sich die RNAi 12 und 24 Stunden nach Injektion nicht nachweisbar auf die Amplitude der Reizantwort auf langwelliges (grünes) Licht in Relation zur Antwort auf mittel- und kurzwellige Stimulation (blau und UV) aus. Der Vergleich der Form der Reizantworten zwischen der abendlichen und der morgendlichen Messung offenbarte jedoch eine Veränderung in der Relation der ERG-Komponenten zueinander. Diese Veränderung fiel in Experimental- und Kontrolltieren unterschiedlich aus. Die Ergebnisse erweitern und bestätigen die bisher bekannten Hinweise, dass das visuelle System der Honigbiene einem zirkadianen Rhythmus unterliegt, charakterisiert durch ein tageszeitabhängiges Volumen der Proteinmenge des LW-Opsins sowie die Ausprägung verschiedener Komponenten des ERGs. Auch die unterschiedliche Wirksamkeit der RNAi zu verschiedenen Zeitpunkten kann möglicherweise auf den zirkadianen Rhythmus zurückgeführt werden. Ferner wurde im Rahmen dieser Arbeit das Farbenlernen der Honigbiene durch die Weiterentwicklung einer Dressurmethode für fixierte Tiere untersucht. Die Fixierung der Tiere ist von Vorteil für kombinierte Untersuchungen auf physiologischer und Verhaltensebene. Bei der klassischen Konditionierung auf visuelle Stimuli lernten die Tiere die Farbe des belohnten Stimulus, nicht jedoch dessen Intensität. Es zeigte sich, dass die Diskriminationsleistung in fixierten Tieren schwächer war als in frei fliegenden Tieren. Die Art der Konditionierung (absolut oder differentiell) beeinflusste die Stärke der Generalisierung. Für die gelernte Farbe bildeten die Tiere ein stabiles Gedächtnis, das mindestens eine Stunde anhielt.

The present thesis aims to widen our understanding of the visual system of the honeybee Apis mellifera by new molecular biological and behavioral methods. RNA Interference (RNAi) was used to specifically down-regulate the expression of an opsin being the protein component of the photosensitive visual pigment in the photoreceptor membrane and determining the receptor’s spectral sensitivity. There are three different types of photoreceptors in the bee retina. The L-receptor, sensitive to long wavelength, was chosen as target because of its main role in the coding of chromatic and achromatic visual information. The inhibition was assessed by molecular biological and electrophysiological methods. In addition a behavioral test was developed to investigate color perception and learning in restrained animals. The effect of RNAi on the expression of the long-wavelength sensitive opsin (LW opsin) mRNA was evaluated by Real Time PCR revealing a down-regulation of up to 60%. The effect was transient and restricted to the injected retina. A minimum amount of 5µg of double-stranded RNA was needed to detect a significant inhibition. The amount of LW opsin protein was quantified by means of an antibody developed for the LW opsin of a bumblebee using SDS PAGE and Western Blots. Repetitive sampling of non-injected animals revealed a natural oscillation of the protein within 24 hours, with a peak eight hours after beginning of the light period and a subsequent decrease of almost 50%. Twelve hours after the injection of double-stranded RNA a reduction effect of about 25% was measured when the injection occurred at the beginning of the light phase. If the treatment was administered at the end of the light phase, no down-regulation was detected after the same period of time of 12 hours, nor after longer time periods. The effect of RNAi on the signal responses in the bee retina was assessed through recording electroretinograms (ERG) 12 and 24 hours after a morning injection. No reduction was detectable when the amplitude of responses to long wavelength (green light) were normalized against the responses to short and medium wavelength (UV and blue light). However, the shape of the ERG response to the light stimuli changed between the two measurements through the differential expression of the transient components of the ERG. These changes were different in experimental and control groups. These results supplement and confirm earlier established findings that indicate influences of circadian rhythm on visual functions in the visual system of the honeybee. These effects have been characterized here by a change in the amount of LW-opsin protein and the shape of the ERG over the day. The difference in the efficiency of the RNAi is most likely also related to the circadian rhythm. In addition, I further developed a behavioral test for the investigation of color learning in restrained honeybees. Restraining the animals bears the possibility of simultaneous investigation of physiological processes and behavior. The classical conditioning to colored light stimuli revealed that the animals learned the colour of a light stimulus but not its intensity. Comparing the results obtained to the performance of free-flying bees, colour discrimination was poor. In addition, a strong tendency for colour generalization was revealed. This generalization depended partly on the conditioning procedure, e.g. whether bees were conditioned absolutely or differentially. Bees formed a stable memory for the learned colour that lasted at least for one hour.