Early genomic response to X-ray induced DNA damage and transposon regulation in Arabidopsis thaliana

Abstract

In this study two major topics were investigated. The first part deals with the early genomic response to DNA damage with particular emphasis on transposable elements (TEs). The second part aims to improve Ac transposition by suppressing the formation of mis-processed Ac transcripts by introducing point mutations in the Ac transposase coding sequence. 1) DNA damage and TEs Double-strand breaks (DSBs) can lead to genome instability and transcriptional and transpositional reactivation of TEs. However the mechanism underlying this process is not well understood. Two different strategies were applied to generate DSBs and to follow transposon reactivation activity. Initially four coding sequences of meganuclease (ISI-opA, I-Sce I, ZFN3 and QQR), under the control of an estradiol-inducible promoter, and their respective target sites were introduced into the genome of Arabidopsis. Only the I-Sce I endonuclease, encoded by the Arabidopsis codon-optimized sequence ISI-opA, successfully generated DSBs after estradiol induction. However, the expected downstream response to DSBs was not observed probably due to a low frequency of introduced breaks into the genome. As an alternative strategy, X-rays were used to generate DSBs in the Arabidopsis genome. To compare the transcriptome- wide early response to DSBs in WT and the DNA-repair-defective mutant atm, the RNA-seq technology was used as a tool. 1315 and 644 genes were found to be ≥2-fold regulated in WT and atm respectively, largely consistent with previous microarray-based transcriptome studies. However, the RNA-seq technology allowed obtaining additional information concerning previously undetected events in the genome response. RNA-Seq data revealed that, in contrast to the large number of regulated genes, TEs/TE-related elements were less responsive on transcriptional level to DSBs, at least in the early response (3h after the treatment). The DSBs induced transcriptional activation of TEs/TE-related elements observed in this study is consistent with previous published data. However, in this work DNA damage induced transcriptional down-regulation of TEs/TE-related elements was detected at transcriptome level for the first time. Among the regulated TEs, retrotransposons were more responsive to X-ray than DNA transposons. In WT plants, 68 % of the regulated TEs/TE-related elements were associated with long non-coding RNAs (lncRNAs). In addition, several differentially expressed novel transcripts were detected and were also identified as lncRNAs. In total, 91 regulated lncRNAs were identified in WT, but only 18 in the atm mutant. The observation indicated that lncRNAs were regulated by ATM in response to X-ray induced DSBs in Arabidopsis. The epigenetic machinery is associated with DNA damage repair and the regulation of TEs. In this study, the de novo DNA methylation gene DRM1 was the only up- regulated DNA methyltransferase gene induced by X-ray. The demethylase gene JMJ30 and two RNA-directed DNA methylation (RdDM) genes AGO2 and AGO7 were also upregulated. In order to further investigate the roles of these epigenetic-related genes in regulating TEs/TE-related elements and lncRNAs in response to DSBs, the Arabidopsis T-DNA insertion knock-out lines drm1, jmj30, ago2 and ago7 mutant were X-ray treated. BRCA1 repairs DSBs via homologous recombination. DRM2, the homolog of DRM1, is the mainly active methyltransferase for de novo DNA methylation and AGO4 is the key player in the RdDM pathway. The corresponding T-DNA insertion lines were also irradiated. The phenotypical analysis of mutants and the quantitative expression analysis of a subset of TEs/TE-related elements and lncRNAs via qRT-PCR indicated that DNA damage repair genes and genes involved in epigenetic control might selectively regulate TEs/TE-related elements and lncRNAs in response to DSBs. 2) Improvement of Ac transposition in Arabidopsis Previous studies have reported that the expression of Ac in Arabidopsis results in a low germinal excision rate which might be due to the occurrence of cryptic introns and early terminated Ac transcripts. Site-directed mutagenesis of Ac was used in the present study in order to prevent mis- processing and incorrect splicing of Ac transcripts and to improve Ac transposition frequency. However, the modified AcTPase coding sequence did not increase transposition frequency. Additional studies are needed to determine if the different transcription-controlling mechanisms in Arabidopsis and maize might be responsible for the occurrence of mis-processed Ac transcripts in Arabidopsis.

In dieser Arbeit wurden zwei Hauptfragestellungen bearbeitet. Im ersten Teil wurde die schnelle genomische Antwort auf DNA Schäden untersucht, wobei der Schwerpunkt auf die transponierende Elemente (TEs) gelegt wurde. Ziel des zweiten Teils der Arbeit war es, die Transposition des Ac Transposons zu verbessern. Dazu wurden Punktmutationen in die kodierende Sequenz des Ac Transposons eingefügt, um die Anzahl an mis-prozessierten Ac Transkripten zu verringern. 1) DNA Schädigung und TEs DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) können die Integrität des Genoms negativ beeinflussen. Eine der Folgen kann die transkriptionelle und transpositionelle Reaktivierung von Transposons sein. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen hinter dieser Beobachtung ist jedoch limitiert. Es wurden zwei Strategien angewandt, um DSBs zu erzeugen und die Reaktivierung der Transposonaktivität zu untersuchen. Zunächst wurden die kodierenden Sequenzen der vier Meganukleasen ISI-opA, I-Sce I, ZFN3 und QQR und ihre Erkennungssequenzen in Arabidopsis transformiert. Für die Kontrolle der Expression der Meganukleasen wurde ein Östradiol-induzierbares System verwendet. Lediglich nach der Expression der I-Sce I-Endonuklease, die durch die Arabidopsis-optimierte kodierende Sequenz ISI-opA kodiert wurde, konnten DSBs erfolgreich generiert werden. Allerdings konnten die erwarteten Antworten auf die DSBs im Genom nicht beobachtet werden, was vermutlich auf eine zu geringe Anzahl an DBSs zurückzuführen war. Alternativ wurden Arabidopsis-Pflanzen Röntgenstrahlen ausgesetzt, um DSBs zu generieren. Zur umfassenden Analyse von frühzeitigen, transkriptionellen Reaktionen auf solche Ereignisse im Wildtyp und in der im DNA Reparaturmechanismus defizienten Mutante atm wurde die Technologie der RNA-Sequenzierung (RNA-seq) verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass 1315 Gene in Wildtyp-Pflanzen und 644 Gene in der atm-Mutante mehr als zweifach reguliert waren. Die erhaltenen Daten entsprachen den Ergebnissen vorheriger Microarray-Untersuchungen zu DNA- Schäden in Arabidopsis, wobei die Verwendung der RNA-Seq Technologie es ermöglichte, neue Informationen über bislang unbekannte Vorgänge bzw. Mechanismen der schnellen Genomantwort zu erhalten. So konnte gezeigt werden, dass TEs und TE-ähnliche Elemente im Gegensatz zu den meisten regulierten Genen weniger auf DSBs reagieren (bezogen auf die Analyse 3h nach der Röntgenbehandlung). Die durch DSBs induzierte Aktivierung von TEs und TE- ähnlichen Elementen ist konsistent mit bereits publizierten Artikeln. Allerdings konnte nun erstmalig auch eine Herunterregulierung von TEs und TE- ähnliche Elementen durch Schädigungen der DNA auf Transkriptionsebene beobachtet werden. Unter allen regulierten TEs, reagierten Retrotransposons stärker auf Röntgenbestrahlung als DNA Transposons. In Wildtyp-Pflanzen waren 68 % der regulierten TEs und TE-ähnliche Elemente mit sogenannten langen- nicht-kodierenden RNAs (long non-coding RNAs, lncRNAs) assoziiert. Weitere, bisher unbekannte und differentiell exprimierte Transkripte konnten ebenfalls als lncRNAs identifiziert werden. Insgesamt wurden 91 lncRNAs in Wildtyp- Pflanzen reguliert, aber lediglich 18 in atm-Mutanten. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass lncRNAs als Antwort auf Röntgenstrahlen-induzierte DSBs in Arabidopsis durch ATM reguliert werden. Die epigenetische Maschinerie ist mit der Reparatur von DNA Schäden und der Regulierung von TEs assoziiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass DRM1 als einzige DNA Methyltransferase durch Röntgenstrahlen in seiner Genexpression hoch-reguliert wurde. Das Gen der Demethylase JMJ30 als auch die Gene AGO2 und AGO7, die in der RNA-vermittelten DNA-Methylierung (RdDM) involviert sind, wurden ebenfalls in ihrer Expression hoch-reguliert. Um den regulatorischen Einfluss dieser Gene auf TEs/TE-ähnlichen Elementen und lncRNAs zu analysieren, wurden die Arabidopsis T-DNA Insertionslinien drm1, jmj30, ago2 und ago7 mit Röntgenstrahlen behandelt. BRCA1 ist an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen der DNA mittels homologer Rekombination beteiligt. DRM2, ein Homolog von DRM1 ist die wichtigste Methyltransferase für die de novo DNA Methylierung und AGO4 ist eine Schlüsselkomponente im RdDM Weg. T-DNA Insertionslinien dieser Mutanten wurden ebenfalls mit Röntgenstrahlen behandelt. Die phänotypische Analyse der Mutanten, sowie die Expressionsanalyse ausgewählter TEs/TE- ähnlicher Elemente und von lncRNAs mittels qRT-PCR deuten darauf hin, dass Gene mit Funktion in der DNA-Reparatur und der epigenetischer Kontrolle von TEs/TE-ähnlichen Elementen und lncRNAs gezielt durch DSBs reguliert wurden. 2) Verbesserung der Ac Transposition in Arabidopsis In früheren Studien wurde gezeigt, dass die Expression von Ac in Arabidopsis zu einer verringerten germinalen Exzisionsrate führt. Dies könnte eine Folge von kryptischen Introns und vorzeitig abgebrochenen Transkripten sein. Um eine Misprozessierung und ein inkorrektes Spleißen von Ac Transkripten zu reduzieren und somit die Transpositionsfrequenz von Ac zu erhöhen, wurde eine zielgerichtete Mutagenese der kodierenden Sequenz von Ac durchgeführt. Jedoch führte dieser Versuchsansatz zu keiner Erhöhung der Transpositionsfrequenz in Arabidopsis.