On the functional relevance of the gene DEP domain containing 1 in breast cancer cells

Abstract

Background / Aims: Breast cancer is the most frequent cancer among women. In Germany, 50,000 women are expected to be diagnosed with breast cancer every year, ranking first over all the other diagnosed forms of cancer among women. DEP domain containing 1 (DEPDC1) has been implicated recently to play a critical role in carcinogenesis. In a previous study, it was found to be highly expressed already during early stages of breast cancer. Therefore, in order to better understand the possible relation of the DEPDC1 gene and breast cancer, appropriate breast cancer cell lines were selected to examine the expression of this gene. In addition, the functional role of DEPDC1 in proliferation, apoptosis, cell cycle and migration was analyzed. Materials and Methods: Expression of the DEPDC1 gene was analyzed in five breast cancer cell lines by GAPDH-controlled real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR). By DEPDC1 siRNA transfection, DEPDC1 was silenced in the MDA-MB-231 breast cancer cell line, which displayed the highest amount of mRNA DEPDC1 expression. The functional effects of DEPDC1 knockdown in MDA-MB-231 cells were analyzed using the Calcein-AM assay for pro-liferation, the FITC Annexin V detection for apoptosis, Flow cytometry assay for nuclear DNA content distribution in cell cycle, and Boyden Chamber assays for invasion. Moreover, DEPDC1 was overexpressed stably by transfection into the MCF-7 breast cancer cell line, which normally expressed the DEPDC1 gene only at a low level. The DEPDC1 gene was obtained by PCR from MDA-MB-231 cells and then subcloned into pcDNA3.1 vector. Transfection of the DEPDC1 plasmid was followed by G418 selection to assure stable cloning of DEPDC1. Immunocytochem-istry confirms DEPDC1 overexpression on the protein level. The functional effects of DEPDC1 overexpression in MCF-7 cells were analyzed by using Calcein-AM assay for proliferation, FITC Annexin V Apoptosis Detection with and without 3-hour 37°C rolling incubation for apoptosis, and wound healing assays for migration. Results: Among all breast cancer cell lines studied, MDA-MB-231 cell showed the highest DEPDC1 mRNA-expression, while MCF-7 cells expressed DEPDC1 at a very low level. MDA-MB-231 cells treated with DEPDC1 siRNA grew much slower than control cells with a maximal inhibition of 62% at 72 h. This treatment resulted also in more apoptotic cells in both early and late stage of apoptosis, led to cell arrest in S phase and a significant loss of invasion capacity. Regarding the MCF-7 cells, clones could be established which have been transfected with DEPDC1 plasmid (including test 6, test 7 and test 10). Compared to the non-treated cells, the cells in test groups grew much faster with a maximal activation of 40% in test 7 at 72 h. However, conflicting findings were obtained in apoptosis assay. Most interestingly, MCF-7 clone test 7 cells bearing high DEPDC1 expression were similar to MDA-MB-231 cells, showing a significantly increased wound closure. Conclusion: This study, for the first time, indicates a relationship between DEPDC1 and aggres-siveness of breast cancer cells and demonstrates that DEPDC1 could be a novel therapeutic target for inhibiting cell growth in breast cancer. The inhibition of DEPDC1 is strongly associated with proliferation, apoptosis, cell cycle, invasive ability and therefore related to breast cancer progres-sion. However, although DEPDC1 overexpression in MCF-7 cells has significant effects in prolif-eration and migration, we have to note that the overexpression of DEPDC1 here is not a perfect model to analyse the functional role DEPDC1 plays within the organism. Further analysis of DEPDC1 at protein level and in vivo study may add to a better understanding of the relevance of this gene for breast cancer. Moreover, studies on the mechanisms of action of DEPDC1 in breast cancer can probably help to develop new therapeutic approaches.

Hintergrund / Ziele: Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen. In Deutschland erkranken jedes Jahr etwa ca. 50.000 Frauen an Brustkrebs. Dem Gen DEP doamin containing 1 (DEPDC1) wird seit kurzem einer kritischen Rolle für die Karzinogenese verschiedener Tumorarten zugeschrieben. In einer früheren Studie unserer Arbeitsgruppe wurde eine erhöhte Expression von DEPDC1 bereits in frühen Stadien von Brustkrebs gefunden. Das Ziel dieser Arbeit war es die Rolle von DEPDC1 für die Proliferation, Apoptose, Zellzyklus und Migration von Brustkrebszellen besser zu verstehen. Materialien und Methoden: Die Expression des DEPDC1-Gens wurden in fünf Brustkrebs-Zelllinien über quantitative real- time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) analysiert. Durch DEPDC1 siRNA Transfektion wurde die Expression von DEPDC1 in der MDA-MB-231 Brustkrebs- Zellenlinie inhibiert, die die höchste mRNA Expression von DEPDC1 zeigte. Die funktionellen Auswirkungen einer DEPDC1 Inhibition in MDA-MB-231-Zellen wurden unter Verwendung der Calcein-AM-Probe für die Proliferation, von FITC Annexin V Apoptosis Detection zur Bestimmung der Apoptose und Flow Cytometry mit Propidium Jodid für die Zellzyklus-Analyseuntersucht. Für Messungen der Invasion wurde ein Boyden-Chamber Assay eingesetzt. In einem zweiten Ansatz wurde DEPDC1 durch Transfektion in MCF-7 Brustkrebs-Zellenlinie überexprimiert, die das DEPDC1-Gen normalerweise nur sehr gering exprimiert. Das DEPDC1-Gen wurde durch PCR von MDA-MB-231 Zellen isoliert und in den pcDNA3.1 Vektor eingebaut. Nach der Transfektion des DEPDC1 Plasmids wurde unter G418 Gabe eine Selektion der Zellklone durchgeführt. Die Überexpression von DEPDC1 konnte in immunocytochemischen Untersuchungen bestätigt werden. Anschließend wurden die funktionellen Auswirkungen der DEPDC1 Überaktivität in MCF-7 Zellen untersucht. Dies wurde wie oben dargestellt durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Wundheilungsassay für die Untersuchung der Migration der Zellen eingesetzt. Ergebnisse: Unter allen untersuchten Brustkrebs- Linienzellen zeigten die MDA-MB-231 Zelle die höchste DEPDC1 mRNA-Expression, während MCF-7 Zellen DEPDC1 nur auf sehr niedrigem Niveau aktiv waren. MDA- MB-231-Zellen, welche mit DEPDC1 siRNA behandelt wurden wuchsen signifikant langsamer. Diese Behandlung verstärkte auch sowohl das Früh- und Spätstadium der Apoptose. Weiterhin führte die Behandlung zu einem Arrest der Zellen in der S-Phase und zu einem signifikanten Verlust der Invasionskapazität. Die MCF-7 Zellen, die DEPDC1 überexprimierten wuchsen schneller und zeigten eine erhöhte Migrationsfähigkeit, die der von MDA-MB-231 Zellen entsprach. Widersprüchliche Ergebnisse wurden im Apoptose Assay für MCF-7 Zellen erzielt. Schlussfolgerung: Diese Studie zeigt zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einer erhöhten DEPDC1-Expression und der Aggressivität von Brustkrebs-Zellen. Die Resultate legen nahe, dass DEPDC1 ein neuartiges therapeutisches Ziel für die Hemmung des Zellwachstums bei Brustkrebs sein könnte. Die Hemmung der DEPDC1-Expression verringert signifikant Proliferation, Zellteilung, Apoptose, und Invasionsfähigkeit von MDA-MB-231 Zellen. Entsprechende Ergebnisse wurden nach Überexpression von DEPDC1 in MCF-7 Zellen gefunden. Weitere Analysen des DEPDC1-Gens auf der Proteinebene und durch in vivo-Studien sind zum besseren Verständnis der Rolle dieses Gens für Brustkrebs erforderlich. Darüber hinaus könnten solche Studien möglicherweise helfen neue therapeutische Ansätze zu entwickeln, die auf der Inhibition des DEPDC1 fußen.