Kernmagnetresonanzspektroskopische Untersuchungen der Dynamik von HLA-B*27

Abstract

Die Allelgruppe HLA-B*27 ist genetisch mit ankylosierender Spondylitis (AS) assoziiert. AS führt zur Entzündung und Verknöcherung der Wirbelsäulengelenke, starken Schmerzen und Verlust von Lebensqualität. MHC-Klasse-I-Moleküle wie HLA-B präsentieren T-Zellen des Immunsystems Peptid-Antigene, weshalb AS als mögliche Autoimmunerkrankung diskutiert wird. Schon der Austausch einer einzigen Aminosäure von HLA-B erhöht drastisch das Erkrankungsrisiko für AS. So ist der Subtyp HLA-B*27:05 stark und HLA-B*27:09 nicht mit der Krankheit assoziiert. Die Ursachen dafür sind unbekannt. Die Subtypen unterscheiden sich durch die polymorphe Aminosäure 116 am Boden der Peptid-Bindefurche, die bei B*27:05 ein Aspartat, in B*27:09 aber durch ein Histidin ersetzt ist. Aus biophysikalischen Untersuchungen und Molekulardynamiksimulationen ist eine peptidunabhängig erhöhte Flexibilität der helikalen Regionen von B*27:05 bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe von Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) die strukturelle Dynamik der beiden Subtypen, jeweils in Komplex mit den self-Peptiden TIS (RRLPIFSRL) oder pVIPR (RRKWRRWHL), charakterisiert werden. Dies sollte mit semiquantitativer Linienformanalyse, Relaxationsmessungen und model-free-Analyse geschehen. Die untersuchten HLA-B*27-Komplexe zeigten eine große Spanne dynamischen Verhaltens. Die α1-α2-Domäne von HLA-B*27 besaß eine liganden- und subtypabhängig stark variierende Flexibilität auf der intermediären bis langsamen NMR-Zeitskala (Mikro- bis Millisekunden). In B*27:05 zeigte sich meist intermediärer Austausch in der α1-Helix, HLA-Moleküle im Komplex mit TIS neigten zu Austausch auf langsamen Zeitskalen in beiden Subtypen. Die model- free-Analyse detektierte eine hohe peptidabhängige Flexibilität der α2-Helix in B*27:09. Die Bindestelle für den CD8-Korezeptor und das Chaperon Tapasin (Reste 223-226 der α3-Domäne) konnte als plastisch charakterisiert werden. Diffusionsmodelle zeigten, dass die α3-Domäne peptid- und subtypabhängig vom Restkomplex dissoziieren kann. Das TIS-Peptid zeigte im Komplex subtypabhängige Unterschiede in seiner Dynamik. Diese Erkenntnisse haben weitreichende Folgen für das Verständnis der Dynamik von MHC-Molekülen, da die Bindung an den T-Zell-Rezeptor auch entropischen Beiträgen unterworfen ist. Die differenzielle Interdomänenflexibilität rückt Korezeptoren als mögliche allosterische Regulatoren der Bindetaschenmobilität in den Fokus. Mit der ersten vollständigen Zuordnungen der chemischen Verschiebungen von MHC Klasse-I-Molekülen legen diese Ergebnisse den Grundstein für die NMR-Analyse von HLA-B*27 und weiteren krankheitsassoziierten Klasse-I-Molekülen. Zum ersten Mal konnten an diesem bedeutenden Molekül experimentell hochauflösende strukturdynamische Informationen gewonnen werden, die mit biologisch- funktionellen Daten korreliert werden können.

The allele group HLA-B*27 is genetically associated with Ankylosing Spondylitis (AS). The disease causes inflammation and ossification of the spine, pain and loss of quality of life. AS is probably an autoimmune disease, as HLA molecules present peptide antigens to the T cells of the immune system. Already a single-residue exchange dramatically increases the risk of contracting AS. While the subtype HLA-B*27:05 is strongly associated with the disease, HLA-B*27:09 is not. The causes remain unexplained. The two subtypes differ only by a polymorphic amino acid at position 116, which is an aspartate in B*27:05 and a histidine in B*27:09. Biophysical studies and molecular dynamics simulations detected an peptide-independent increased flexibility in the helical regions of B*27:05. Using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, I explored the structural dynamics of the two subtypes, each complexed with one of the two self-derived peptides TIS (RRLPIFSRL) or pVIPR (RRKWRRWHL). This was done by semiquantiative line shape analysis and model- free analysis of 15N relaxation. All HLA-B*27 complexes showed a remarkable range of dynamic behaviour. Parts of the helices of the α1-α2-superdomain exhibited a great degree of mobility on an intermediate-to-slow timescale (micro- to milliseconds) in a ligand- and subtype-dependent fashion, which is reflected by diminishing NH signal intensities and the occurrence of multiple conformational states. HLA-B*27:05 seems to have a remarkably dynamic alpha1 helix, while TIS seems to exert mobility on slow timescales to slow timescales in both subtypes. Model-free analysis detected peptide-dependent structural plasticity in the α2 helix of B*27:09. The signals of residues 223-226 of the α3 domain are not visible in any of the complexes, which emphasises the plasticity of the binding site for both the CD8 co-receptor and chaperone tapasin. Diffusion models suggest that the α3 domain may dissociate from the complex in a ligand- and subtype-dependent manner. Also the peptide TIS in the complex exhibited subtype-dependent mobility differences. These results help understand the structural dynamics of MHC molecules, since interaction with the T cell receptor also depends on entropic contributions. Based on the differential inter-domain flexibility, I propose a role for co-receptors as allosteric regulators of binding groove flexibility. The first assignments of an MHC class-I molecule's backbone pave the way for further studies on disease associated class-I molecules. For the first time, high-resolution protein dynamics information could be experimentally obtained, which may be correlated with functional data.