Protein translation processes during long-term memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.)

Abstract

The aim of this work was to describe the involvement of protein translation processes in the formation of long-term memory during classical, olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera). Special attention was given to the elongation phase of translation and its main regulatory factor: eEF2 (eukaryotic elongation factor 2). Since the eEF2 kinase (eEF2K) responsible for phosphorylating and thus regulating of eEF2 was not yet detected (and even suggested not to exist) in insects, I designed a set of in vitro experiments to test the existence of a kinase capable of phosphorylating eEF2. cAMP and Ca2+ increase eEF2 phosphorylation in mammals, so they were added to the honeybee brain homogenates and raised eEF2 phosphorylation level. This experiment provides a strong argument for the existence of a functional homologue of the eEF2K in the honeybee and is the first indication that such a kinase exists in insects. To check if memory processes modulate the elongation phase of translation in the honeybee, the animals were trained using classical, olfactory conditioning paradigm. Learning trials transiently decreased eEF2 phosphorylation (increased its activity) 10 min after learning and this augmentation came back to the baseline levels 2 h later. Total amount of eEF2 remained constant. This suggests that conditioning trials transiently, in the range of a dozen of minutes, boost the elongation phase of translation. Trying to elaborate signalling pathways involved in learning-induced eEF2 activation TOR protein (a known regulator of translation system) was inhibited with rapamycin. After strong conditioning protocol (3 trial conditioning) memory performance was not deteriorated. Surprisingly, when a weak protocol (1 trial conditioning) was applied in the presence of rapamycin, memory was enhanced in the range of hours and days. This memory increment may be explained by the rapamycin-induced activation of the cap-independent initiation of translation. In order to establish pathways concomitantly regulating eEF2 and memory processes, glutamate was uncaged in the honeybee brain. This action increased total amount as well as phosphorylation level of eEF2 within 15 min after stimulation. Increase in total amount of eEF2, a central component in the translation process, should increment translational capacity, what according to a new hypothesis may represent a novel mechanism contributing to synaptic plasticity and LTM formation. To examine the involvement of proteasome, the protein degradation machinery, in memory formation and maintenance processes, this structure was blocked by MG132. This chemical injected either before 1 trial conditioning or before the retrieval test at 3 hours increased memory performance at 3 hours, but was ineffective when injected before the retrieval test at day 1. This experiment suggests that in the honeybee, proteasome acts as a negative constraint on memory. In order to determine the localisation of eEF2 protein in the honeybee brain, tissue slices were incubated with anti-eEF2 antibodies. The most intensive staining was found in the protocerebral lobes and in separate bands of the α-lobes of the mushroom bodies. These structures consist mainly of neuropil, suggesting that dendritic rather then perikaryal translation dominates in the honeybee brain. Experiments presented in this thesis provide first insights into protein translation processes in the honeybee brain in the context of LTM formation. They suggest an increase in the elongation rate of protein synthesis cycle after learning and point to an important role of rapamycin and glutamate-dependent pathways in these processes. Existence of a functional homologue of eEF2K in the bee is postulated as well as the involvement of proteasome in memory.

Ziel dieser Arbeit war es, die Beteiligung der Proteinsynthese bei der Bildung des Langzeitgedächtnisses nach klassischer, olfaktorischer Konditionierung in der Honigbiene (Apis mellifera) zu beschreiben. Besondere Aufmerksamkeit galt der Elongationsphase der Translation und ihrem wichtigsten regulierenden Faktor: eEF2 (eukaryotic elongation factor 2). Da die Kinase (eEF2K), die für die Phosphorylierung und folglich für die Regulation von eEF2 verantwortlich ist, in Insekten noch nicht bekannt ist (es wird sogar vermutet, das sie überhaupt nicht existiert), habe ich eine Reihe von in vitro Experimenten durchgeführt, um die Existenz einer solchen Kinase, die eEF2 phosphorylieren kann, zu prüfen. Wie bei Säugetieren steigert cAMP und Ca2+ die Phosphorylierung von eEF2 in der Honigbiene. Dies ist der erste eindeutige Befund dass ein Funktionshomolog der eEF2K auch in der Honigbiene (Insekten) existiert. Um zu überprüfen ob die Elongationphase der Translation in der Honigbiene während der Bildung eines Gedächtnisses moduliert wird, wurden die Tiere nach einem klassischen, olfaktorischen Paradigma konditioniert. Zehn Minuten nach dem Lernen verringerte sich die Phosphorylierung von eEF2 vorübergehend (Aktivitätserhöhung). Dieser Anstieg kam 2 h später zum Ausgangsniveaus zurück. Die Gesamtmenge von eEF2 blieb konstant. Dies lässt vermuten, dass die Elongation im Zeitraum von einigen Minuten nach dem Lernen verstärkt wird. Um herauszufinden, welche Signaltransduktionwege bei der lerninduzierten Aktivierung von eEF2 eine Rolle spielen, wurde TOR (Target of rapamycin), ein bekannter Regulator des Translationsystems mit Rapamycin blockiert. Während sich die Gedächtnisleistung nach einem 3-fachen Konditionierungsprotokoll, nicht verändert, führt Rapamycin nach 1-facher Konditionierung (schwaches Trainingsprotokoll) im Zeitraum von Stunden bis Tagen zu einer verbesserten Gedächtnisleistung. Diese Gedächtnisverbesserung liegt wahrscheinlich an einer Rapamycin-verursachten Aktivierung der cap- unabhängigen Initiation der Translation. Da bekannt ist, dass Glutamat- abhängige Signaltransduktionwege an der Verbesserung der Gedächtnisleistung beteiligt sind, wurde der Einfluß von Glutamatfreisetzung auf eEF2 im Honigbienengehirn untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl die Gesamtmenge als auch das Phosphorylierungsniveau von eEF2 innerhalb von 15 Minuten nach der Stimulation erhöht wurden. Eine Erhöhung der Gesamtmenge von eEF2 würde nach neuen Vorstellungen die Translationskapazität erhöhen. Mit der Glutamat- induzierten Mengenänderung von eEF2 ergeben sich somit erstmals Hinweise auf einen neuen Mechanismus der Tranlationsregulation der zur synaptischen Plastizität und zur Langzeitgedächtnisbildung (LTM) beitragen könnte. Um die Beteiligung der Proteasome, der Proteindegradationsmaschinerie, bei der Gedächtnisbildung und -erhaltung zu untersuchen, wurden die Proteasome mit MG132 blockiert. Blockierung der Proteasome vor der 1-fachen Konditionierung oder vor dem Gedächtnistest nach 3 Stunden, erhöhte die Gedächtnisleistung nach 3 Stunden. MG132 hatte jedoch keinen Effekt, wenn es vor einem Test an Tag 1 (24 h später) injiziert wurde. Dieses Experiment lässt vermuten, dass Proteasome eine hemmende Wirkung auf das Gedächtnis im Stundenbereich haben. Immunhistologische Untersuchungen mit anti-eEF2 Antikörpern zeigen, dass die intensivste Färbung in den protozerebralen Loben und in einigen Bändern der α-Loben der Pilzkörper zu finden ist. Diese Strukturen bestehen hauptsächlich aus Neuropil, was darauf hindeutet, dass dendritische Translation gegenüber perikaryaler Translation in der Honigbiene dominiert. Zusammengefasst gewähren diese Untersuchungen erste Einblicke in die Regulationsprozesse der Proteinbiosynthese im Honigbienengehirn während der Bildung eines Langzeitgedächtnisses. Sie weisen auf eine Zunahme der Elongationsrate des Proteinsynthesezyklusses hin und legen eine wichtige Rolle der Rapamycin- abhängigen Signaltransduktionswege und des Glutamates bei diesen Prozessen nahe. Darüber hinaus wird erstmals die Existenz eines Funktionshomologes von eEF2K in Insekten beschrieben und Hinweise für die Beteiligung der Proteasome bei der Gedächtnisbildung präsentiert.