Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit-associated protein 2 (Cdk5rap2) in neuronal differentiation and germ cell pool maintenance

Abstract

Patients with biallelic mutations in the Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit-associated protein 2 (CDK5RAP2) gene suffer from autosomal recessive primary microcephaly type 3 (MCPH3) and intellectual disability at birth. Microcephaly is due to a reduction of brain volume which affects disproportionately the grey matter. Cdk5rap2 mutant or Hertwig’s anemia mice (an/an) have small brains and thin cortices already at early stages of neurogenesis. Cdk5rap2 is a centrosomal protein highly expressed in the neural progenitor pool. Although the microcephaly phenotype in an/an has been explained by many mechanisms, the exact effect of a loss of Cdk5rap2 function on neurogenesis and neuronal differentiation is not known. On the other hand, Cdk5rap2 is expressed in various tissues, and, thus, other organs in an/an might be affected as well. Indeed, an/an males are infertile secondary to a severe germ cell deficiency. However, the mechanisms behind germ cell loss have not been studied before. The aim of my PhD project was to improve our understanding of the role of Cdk5rap2. First, we aimed to analyse the effects of a loss of Cdk5rap2 function on neurogenesis and on the differentiation of neocortical neurons in an/an. Second, the expression pattern of Cdk5rap2 and the germline defect in an/an prompted us to further analyse the germline development in these mice. In order to study the phenotype of neocortical neurons in an/an, we applied a modified Golgi-Cox staining protocol. We detected a reduction in the dendritic complexity but an increase in the spine density of layer II-III pyramidal neurons in an/an mice when compared to wild type (+/+) littermates. Electrophysiological analysis showed an increase in layer II-III pyramidal neurons mEPSC frequency already at the beginning of synaptogenesis in (P6/7) an/an as a possible correlate for epilepsy in some patients with MCPH. In addition, we reported a critical role of Cdk5rap2 in maintaining the germ cell pool. We found that infertility in an/an is due to an early developmental defect in the germ cells through mitotic delay, prolonged cell cycle and apoptosis. We highlight that a neuronal differentiation defect, especially in the upper cortical layers, contributes to the microcephaly phenotype in MCPH. We also show that Cdk5rap2 plays a major role in maintaining the germ cell pool during development. Understanding the cause leading to infertility is likewise important for understanding the fate of neural progenitors and thus mechanisms leading to microcephaly in MCPH.

Biallele Mutationen im Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit-associated protein 2 Gen (CDK5RAP2) verursachen die Autosomal rezessive primäre Mikrozephalie Typ 3 (MCPH3). Patienten mit MCPH3 weisen eine schwere Mikrozephalie bei Geburt und eine Intelligenzminderung auf. Die Mikrozephalie ist auf eine Reduktion des Hirnvolumens zurückzuführen, die überproportional die graue Substanz betrifft. Cdk5rap2 mutante Mäuse oder Hertwig Anämie Mäuse (an/an) haben bereits im frühen Stadien der Neurogenese kleine Gehirne und dünne Kortizes. Cdk5rap2 ist ein zentrosomales Protein, das im neuronalen Vorläuferpool exprimiert wird. Obgleich einige potentielle Mechanismen, die zur Mikrozephalie der an/an-Mäuse beitragen, publiziert worden sind, ist der genaue Effekt eines Verlustes der Funktion von Cdk5rap2 auf die Neurogenese und die neuronale Differenzierung nicht bekannt. Darüber hinaus wird Cdk5rap2 in verschiedenen Geweben exprimiert, was eine Beteiligung weiterer Organe vermuten lässt. In der Tat sind an/an-Männlichen als Folge eines Verlustes ihrer Keimzellen unfruchtbar. Auch in diesem Fall sind die zugrundeliegenden Mechanismen unklar. Ziel meines Dissertationsprojekts war es, das Verständnis für die Funktion von Cdk5rap2 zu verbessern. Zunächst zielten wir darauf ab, die Auswirkungen eines Verlustes von Cdk5rap2 auf die Neurogenese und die Differenzierung neokortikaler Neurone in an/an-Mäusen zu analysieren. Um den Phänotyp neokortikaler Neuronen in an/an-Mäusen zu untersuchen, wurde ein modifiziertes Golgi Cox-Färbeprotokoll angewendet. Wir fanden eine Verringerung der dendritischen Komplexität, aber eine höhere Dichte an Spines der Neurone in der Rindenschicht II-III in an/an-Mäusen im Vergleich zu Wildtypen (+/+). Darüber hinaus detektierten wir, mittels elektrophysiologischer Untersuchungen, bereits bei Beginn der Synaptogenese eine Zunahme der mEPSC-Frequenz der Neurone in der Rindenschicht II-III in den mutanten Mäusen. Letztere kann ein Korrelat für die bei einigen Patienten mit MCPH beschriebene Epilepsie darstellen. In einem weiteren Teil meines Projekts veranlasste uns das Expressionsmuster von Cdk5rap2 und der Keimbahndefekt in an/an-Mäusen dazu, die Keimbahnentwicklung bei diesen Mäusen weiter zu analysieren. Wir fanden, dass die Infertilität der an/an-Mäuse auf einen frühen Entwicklungsdefekt in den Keimzellen durch eine Verzögerung der Mitose, einen verlängerten Zellzyklus und Apoptose zurückzuführen ist. In meiner Dissertationsarbeit konnte ich somit zusammenfassend zeigen, dass ein neuronaler Differenzierungsdefekt, insbesondere in den oberen kortikalen Schichten, zum Mikrozephalie Phänotyp bei MCPH3 beiträgt. Ich konnte zudem zeigen, dass Cdk5rap2 eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Keimzellpools während der Entwicklung innehat. Das Verständnis der Ursache für die Infertilität ist potentiell entscheidend für das Verständnis von Mechanismen, die zu Mikrozephalie in MCPH führen.