Untersuchung der Rolle der Cytokinine im Primärmetabolismus und bei der Regulierung der sink/source-Verhältnisse in Pflanzen

Abstract

Cytokinin ist ein Phytohormon, das zahlreiche Prozesse in der pflanzlichen Entwicklung kontrolliert. Es beeinflusst wesentlich die sink/source- Verhältnisse in der ganzen Pflanze, indem es den Assimilatmetabolismus und die Assimilatverteilung sowie die Zellteilung reguliert. Die molekularen Mechanismen, welche Cytokinin mit den physiologischen und entwicklungsbiologischen Antworten der Pflanze verknüpfen, sind bisher noch wenig verstanden. Cytokinindefizienz, hervorgerufen durch die Überexpression eines Gens der Cytokinin-abbauenden Arabidopsis Cytokininoxidase/-dehydrogenase (AtCKX), führt zur Reduktion des Sprosswachstums und zur Verstärkung des Wurzelwachstums. Die Untersuchung verschiedener physiologischer Parameter in Wildtyp- und 35S:AtCKX-transgenem Tabak zeigte, dass trotz eines reduzierten Chlorophyllgehaltes die photosynthetische Kapazität und Effizienz sowie der Gehalt an löslichen Zuckern in cytokinindefizienten source-Blättern kaum verändert waren. Die source-Stärke war in cytokinindefizienten Pflanzen demnach wahrscheinlich nicht für das Sprosswachstum limitierend. Im Gegensatz dazu zeigten cytokinindefiziente Spross-sink-Gewebe einen stark reduzierten Gehalt an löslichen Zuckern, reduzierte Aktivitäten der vakuolären und der cytolsolischen Invertasen und einen reduzierten ATP-Gehalt. Dies deutet darauf hin, dass Cytokinin die Spross-sink-Stärke reguliert, und dass ihre Reduktion ein Grund für das verlangsamte Sprosswachstum bei Cytokinindefizienz sein könnte. Transgene Wurzelgewebe enthielten ebenfalls weniger lösliche Zucker, was allerdings keinen negativen Einfluss auf die Glykolyse, den ATP-Gehalt oder das Wurzelwachstum hatte. Das zeigt, dass Cytokinin die sink-Aktivität in Spross und Wurzeln auf unterschiedliche Weise reguliert. In einem funktionellen Komplementationsversuch wurde überprüft, ob Faktoren, die die sink-Stärke regulieren und transkriptionell durch Cytokinin kontrolliert werden, unter Bedingungen der Cytokinindefizienz für das Pflanzenwachstum limitierend sind. So bewirkte beispielsweise die Expression des Gens der Zellwand-Invertase CIN1 von Chenopodium rubrum in 35S:AtCKX1-transgenen Arabidopsispflanzen keine Reversion des Cytokinindefizienzphänotyps. Dies lässt vermuten, dass diese Invertase-Isoform bei Cytokinindefizienz nicht limitierend ist und bei der Vermittlung der Cytokininwirkung keine entscheidende Rolle spielt. Die Expression des Gens von CyclinD3, das den G1/S-Übergang im Zellzyklus positiv reguliert, bewirkte ebenfalls keine Kompensation des Cytokinindefizienzphänotyps, was darauf hindeutet, dass der limitierende Schritt während des Zellzyklus, der durch Cytokinin kontrolliert wird, eher der G2/M-Übergang und nicht der G1/S-Übergang sein könnte, so dass CyclinD3 bei Cytokinindefizienz nicht limitierend ist. Cytokinin induziert die Biosynthese von Trehalose-6-phosphat (Tre6P), das für die Kohlenhydratverwertung essenziell ist. Die Akkumulation von endogenem Tre6P durch Wachstum in Gegenwart von exogener Trehalose (10 mM) bewirkte bei 35S:AtCKX1-transgenen Arabidopsiskeimlingen und auch bei ahk2 ahk3 cre1-Cytokininrezeptormutanten eine Erhöhung der Sprossmassen, während die Wildtypsprossmasse um 30 % reduziert war. Das Wurzelwachstum von 35S:AtCKX1-transgenen Pflanzen war im Gegensatz zum Wildtyp nahezu resistent gegen exogene Trehalose. Die Untersuchungen deuten auf die Möglichkeit hin, dass Cytokinin die Kohlenhydratmobilisierung über den Tre6P-Metabolismus regulieren könnte. Phänotypische Veränderungen aufgrund der lokalen Reduktion des Cytokiningehaltes in verschiedenen Domänen des Sprossapex von Arabidopsis durch gewebespezifische AtCKX3-Expression zeigten, dass Cytokinin im gesamten Sprossapikalmeristem (STM-Expressionsdomäne) und in Organprimordien (ANT- Domäne) für die Regulierung der Meristemaktivität und der Zellteilung wichtig ist. Primordienspezifische Cytokinindefizienz führte zu einer starken Reduktion der Blattgröße aufgrund der blockierten Zellteilung zu Beginn der Blattentwicklung. Der verwendete experimentelle Ansatz lieferte keine Hinweise zur Funktion von Cytokinin im Organisierenden Zentrum (WUS-Domäne) und in Stammzellen (CLV3-Domäne) des Sprossmeristems.

Cytokinin is a phytohormone that controls numerous processes during plant development. It substantially influences sink/source relations in the whole plant by regulating assimilate metabolism and partitioning as well as cell division. However, the molecular mechanisms that link cytokinin with physiological and developmental responses of the plant are still little understood. Cytokinin deficiency induced by overexpression of a gene encoding cytokinin-degrading cytokinin oxidase/dehydrogenase enzyme from Arabidopsis (AtCKX) results in a reduced shoot- and an enhanced root growth. The investigation of different physiological parameters in wild-type and 35S:AtCKX transgenic tobacco revealed that despite a reduced chlorophyll content, photosynthetic capacity and efficiency as well as the content of soluble sugars were not strongly altered in cytokinin-deficient source leaves, suggesting that in cytokinin-deficient plants source strength was not limiting for shoot growth. In contrast, cytokinin-deficient shoot sink tissues exhibited strongly reduced contents of soluble sugars, decreased activities of vacuolar and cytosolic invertases and a reduced ATP content. These results strongly support a function of cytokinin in regulating shoot sink strength and its reduction may be a reason for the retarded shoot growth upon cytokinin deficiency. Transgenic root tissues contained also less soluble sugars, which however did not have negative impact on glycolysis, ATP content or root growth. This may indicate that cytokinin regulates sink activity in shoot and root in a different fashion. In functional complementation experiments, it was tested whether the factors, which are known to regulate the sink strength and which are transcriptionally controlled by cytokinin, are limiting for plant growth under conditions of cytokinin deficiency. For example, the expression of the cell-wall invertase gene CIN1 from Chenopodium rubrum in 35S:AtCKX1 transgenic Arabidopsis plants did not cause a reversion of the cytokinin deficiency phenotype, suggesting that this invertase isoform is not limiting under cytokinin deficiency and does not play a crucial role in mediating cytokinin responses. The expression of cyclinD3, which positively regulates G1/S transition of cell cycle, also did not cause a compensation of the cytokinin deficiency phenotype, indicating that the limiting step during cell cycle progression controlled by cytokinin might be the G2/M transition rather than the G1/S transition and suggesting that cyclinD3 is not limiting under cytokinin deficiency. Cytokinin induces biosynthesis of trehalose-6-phosphate (Tre6P), which is indispensable for carbohydrate utilization. Accumulation of endogenous Tre6P by means of growth in the presence of exogenous trehalose (10 mM) caused an increase in shoot mass of 35S:AtCKX1 transgenic Arabidopsis¬ seedlings and ahk2 ahk3 cre1 cytokinin receptor mutants, whereas wild-type shoot mass was reduced by 30 %. Additionally, root growth of 35S:AtCKX1 transgenic plants was nearly resistant to trehalose in contrast to wild type. These analyses suggest that cytokinin may regulate carbohydrate mobilization via Tre6P metabolism. Phenotypic changes due to local reduction of the cytokinin content in distinct domains of the Arabidopsis shoot apex by tissue- specific AtCKX3 expression revealed that in the whole shoot apical meristem (STM expression domain) and in organ primordia (ANT domain), cytokinin plays an important role in regulating meristem activity and cell division. Primordia-specific cytokinin deficiency resulted in a strong reduction of leaf size due to blocked cell division during early leaf development. The used experimental approach did not provide information about cytokinin function in the organizing centre (WUS domain) and in stem cells (CLV3 domain) of the shoot meristem.