Die Rolle der Insulin-regulierten Aminopeptidase für die mTOR-Signalkaskade

Abstract

Einleitung: Die insulinregulierte Aminopeptidase (IRAP) ist ein ubiquitär im Körper verbreitetes Enzym, das sich in intrazellulären Vesikeln befindet, die unter zellspezifischen Stimuli an die Zelloberflächen reguliert werden können. Als Oxytocinase spaltet IRAP Peptidbindungen, auch ihre Funktion scheint zellspezifisch zu sein. In dendritischen Zellen ist IRAP zusammen mit anderen Enzymen für das aminoterminale Trimming exogener Peptide zuständig, die folglich auf MHC-I an der Zelloberfläche präsentiert werden (Kreuzpräsentation). Es existieren wenige Informationen über die Regulation von IRAP in diesen Zellen. Die Vorarbeiten hierzu ließen eine Verbindung zur mTOR-Signalkaskade herstellen: IRAP befindet sich in dendritischen Zellen in endosomaler Nachbarschaft u.a. mit Rab14 und AS160 (Substrate von mTOR) und wird in das frühe Phagosom rekrutiert, wo auch LAT1, ein wichtiges Upstream- Protein von mTOR, identifiziert werden konnte. Zudem konnte in IRAP- defizienten Zellen eine höhere Autophagieaktivität nachgewiesen werden. Die mögliche Verbindung von IRAP zur mTOR-Signalkaskade sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob IRAP in DC genau wie in insulinsensitivem Gewebe eine Wechselwirkung mit einem Glucosetransporter eingeht. Methoden: Es wurden Wachstumskurven verschiedener Zelltypen (IRAP- Knockout und Wildtyp) angefertigt und die wichtigsten Substrate von mTOR in dendritischen Zellen (IRAP-Knockout und Wildtyp) anhand von Western Blots gemessen. Darüber hinaus wurde anhand von qPCR die Expression von LAT1 und verschiedenen Glucosetransportern in dendritischen Zellen (IRAP-Knockout und Wildtyp) gemessen und verglichen. Ergebnisse: Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass eine IRAP-Defizienz mit einer Aktivitätsminderung von mTOR einhergeht. IRAP-defiziente Zellen (DC und MEF) zeigten ein verlangsamtes Wachstumsverhalten im Vergleich zum Wildtyp. Darüber hinaus ließen sich bestimmte mTOR-Substrate (Akt, S6K) im IRAP-Knockout in geringerer Menge als im Wildtyp nachweisen. In der Expression der Glucosetransporter GluT1 und GluT3 und des Proteins LAT1 konnte kein signifikanter Unterschied zwischen IRAP-defizienten Zellen und Wildtyp-Zellen gefunden werden. Die Ergebnisse der Versuche zu GluT4 zeigten eine etwa sechsmal höhere Expression in IRAP- defizienten Zellen. Dieses Ergebnis muss durch weitere Untersuchungen bestätigt werden. Zusammenfassung: IRAP scheint eine regulatorische Wirkung auf die mTOR-Signalkaskade zu haben, hierbei ist das Modell einer Signaling Platform oder aber ein direkter oder indirekter Regulationsmechanismus denkbar. Eine regulatorische Beziehung von IRAPs Endosom zu einem Glucose- Transporter ist nicht wahrscheinlich.

Background: The insulin-regulated aminopeptidase (IRAP) is a trimming enzyme located in intracellular vesicles of many different cell types. It can be redistributed to the cell surface in response to cell-specific stimuli, for example GluT4 in insulin-sensitive cells. In dendritic cells IRAP plays a pivotal role in the trimming of exogenous peptides for cross-presentation on MHC-I-Receptors. Only few data exist concerning the regulation of IRAP in dendritic cells. Preliminary data of the hostlab suggest spacial and functional links between IRAP and the mTOR-pathway. The spacial links are the endosomal colocalisation of IRAP with Rab14 and AS160 (substrates of mTOR) and IRAP’s recruitment to the early phagosomes with LAT1 (upstream-protein of mTOR). The functional link is an increased autophagic activity found in IRAP- deficient dendritic cells. We have sought to investigate this relation between IRAP and the mTOR-pathway and to find out whether there is a regulatory link between IRAP’s endosome and a glucose-receptor in dendritic cells. Methods: Growth curves of different cell types have been established to compare proliferation between wildtype- and IRAP-deficient cells. The most important mTOR substrates have been analysed by Western Blot in wildtype- and IRAP- deficient dendritic cells. The expression of different glucose-receptors and LAT1 were measured with qPCR in wildtype- and IRAP-deficient dendritic cells. Results: The proliferation of IRAP-deficient dendritic cells and fibroblasts (MEF) was found to be slower than that of their wildtype equivalents. Expression of certain mTOR-substrates (Akt, S6K) was found to be lower in IRAP-deficient dendritic cells. No significant difference concerning the expression of GluT1, GluT3 and LAT1 could be found between wildtype and IRAP- deficient dendritic cells, contrary to this, the expression of GluT4 was higher in IRAP-deficient dendritic cells. Conclusion: Our data suggest a regulatory direct or indirect link between IRAP and the mTOR-pathway, which could be similar to a signaling platform. Contrary to insulin- responsive cells, there seems to be no regulatory link between IRAPs endosome and a glucose transporter in dendritic cells.