Einfluss von Hypoxie und Deferoxamine auf die Beta-1- Integrin- abhängigen Funktionen der Gefäßmuskelzelle

Abstract

Das β1-Integrin spielt eine wichtige Rolle bei Adhäsion, Migration und Spreading der glatten Gefäßmuskelzelle (VSMC). Die Migration der VSMC in die Neointima ist ein entscheidender Schritt im Rahmen der Entstehung atherosklerotischer Plaques. Hypoxie als ein wichtiger Faktor für das Gefäßremodeling beeinflusst Funktionen der VSMC direkt. Die Arbeit beschreibt den Einfluss von Hypoxie und dem Hypoxieimitator DFO auf die β1-Integrinvermittelten Funktionen der VSMC auf den extrazellulären Matrixproteinen Kollagen I und Fibronektin. Es konnte eine Steigerung der drei Funktionen Adhäsion, Spreading und Migration auf den extrazellulären Matrixproteinen Kollagen I und Fibronektin gezeigt werden. Die Untersuchungen ergaben ein gleichgerichtetes Verhalten der drei Zellfunktionen auf beiden Proteinen. Die Konzentrationen von Kollagen I und Fibronektin scheinen keinen Einfluss auf die generelle Ausprägung der Zellfunktion zu haben. Die durch Hypoxie bewirkten Funktionssteigerungen sind in Richtung und Ausmaß mit denen durch DFO identisch. Der durch Hypoxie ausgelöste Effekt auf die Adhäsion ist nach 24stündiger Normalisierung des Sauerstoffgehalts vollständig reversibel. Neben seiner Funktion als Adhäsionsmolekül ist das β1-Integrin auch aktiv an der Signaltransduktion beteiligt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit auch die Auswirkungen von Hypoxie und DFO auf die Enzymkaskaden MAP-Kinase und Proteinkinase C untersucht. Sowohl Hypoxie als auch DFO bewirkten eine Aktivierung der MAP-Kinase und Proteinkinase C. Diese beiden Enzyme scheinen die gezeigten gesteigerten Zellfunktionen zu induzieren, da durch pharmakologische Inhibierung sowohl der Proteinkinase C als auch der MAP- Kinase die Effekte von Hypoxie und DFO signifikant inhibiert werden konnten. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass Hypoxie den PKC Subtyp ε aktiviert. Die Frage, ob die gesteigerten Zellfunktionen möglicherweise durch eine Erhöhung der β1-Integrine bedingt seien, wurde durch RT-PCR und Durchflusszytometrie untersucht. In beiden Fällen wurde eine gleichbleibende Integrinmenge nach Hypoxie/DFO festgestellt. Dagegen gelang der Nachweis einer hypoxieinduzierten Aktivierung des β1-Integrins durch die Verwendung eines Antikörpers gegen ein nur im aktivierten Integrin exprimiertes Epitop in der Durchflusszytometrie.

Beta-1-Integrins play an important role for adhesion, migration and spreading of vascular smooth muscle cells (VSMC). Migration of VSMC in the neointima is a key event in the development of atherosklerotic plaques. Hypoxia is an important factor for vascular remodeling and directly affects VSMC functions. This study investigates the influence of hypoxia (1% O2, 24h) and Deferoxamine (DFO, 50microM, 24h) on the beta-1-integrin mediated functions in relation to adhesion, migration and spreading of VSMC on the extracellular matrix proteins collagen I and fibronectin. This study concerns hypoxia and DFO increased adhesion, migration and spreading to collagen I and fibronectin. The exams showed the same pattern of all three cell functions on both proteins. The extent and direction of the effects caused by hypoxia are identical to those caused by DFO. The hypoxia-induced increased adhesion of VSMC is completely reversibel following a 24 hour exposure to normal oxygen-levels. Aside from its function as an adhesion molecule, the beta-1-integrin plays an important role in cell signaling. Therefore, this study also investigated the effect of hypoxia and DFO on the intracellular enzyme cascades mitogen-activated- protein-kinase (MAPK) and protein-kinase C (PKC). Hypoxia activated ERK1/2-MAPK and p38-MAPK in human VSMC. MAPK and PKC seem to induce an increased cell function, as pre-treatment with the pharmacological ERK1/2 -MAPK-inhibitor PD98059 (30 microM), the p38-MAPK-inhibitor SB203580 (1microM) and the PKC-inhibitor phorbole-myristate 13-acetate (PMA; 1microM, 24h) abolished the effects induced by hypoxia and DFO significantly. Furthermore, hypoxia also activated the PKC subtype epsilon. The question of whether an increase in cell function was caused by a higher amount of beta-1-integrins was investigated by flow cytometry and rt-PCR. Neither hypoxia nor DFO could alter the beta-1-integrin protein or mRNA-levels. As shown by flow cytometry hypoxia induced beta-1-integrin by exposing a conformationally sensitive epitope on the beta-1-subunit.