Akute Neurodegeneration nach intraventrikulärer Injektion von synthetisch hergestellter siRNA im Gehirn der Ratte

Abstract

Die RNA-Interferenz ist eine effektive Methode zur gezielten Inaktivierung von Genen in vivo. Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass die intraventrikuläre Verabreichung von synthetisch hergestellter short interfering RNA (siRNA), welche gegen beta-Tubulin gerichtet ist, konzentrationsabhängig eine Interferon-Antwort im zentralen Nervensystem der Ratte induziert. Es werden neurodegenerative Veränderungen in vivo hervorgerufen. Nach der intrathekalen Gabe von siRNA oder von Polyinosinic Polycytidylic Acid (polyI:C) werden die Proteinlevel der Proteinkinase R (PKR) und des eukaryotischen Initiationsfaktor 2-alpha (eIF2-alpha) erhöht. polyI:C wird als potenter Induktor der Interferonantwort als Positivkontrolle verwendet und bewirkt eine obligate Steigerung der PRK-Konzentration. PKR und eIF2-alpha sind beides Proteine, die bei der Signalwirkung der Interferon-Antwort beteiligt sind. Die Interferon-Antwort steht in Verbindung mit einem neuronalen Zelluntergang in den periventrikulären Gebieten. Der neuronale Zelluntergang ist assoziiert mit morphologischen Zeichen einer eosinophilen Degeneration in der HE-Färbung sowie der zytoplasmatischen Bindung von Fluoro-Jade B (FJ). FJ bindet als anionisches Fluoreszeinderivat spezifisch an unbekannte Bindungsstellen von degenerativen Neuronen. In den FJ-Färbungen zeigen sich die degenerativen Nervenzellen in den periventrikulären Arealen und belegen die zellulären Auswirkungen von siRNA. Der erhöhte Proteingehalt der PKR und eIF2-alpha sowie die neurodegenerativen Veränderungen sind nach Gabe des nichtsteroidalen Antiphlogistikums Ibuprofen rückläufig. Ibuprofen scheint die Induktion der allgemeinen Interferon-Antwort zu unterdrücken. Es wird eine regelrechte Zellmorphologie von Glia- und Nervenzellen nachgewiesen. Die Beobachtung, dass siRNA neurodegenerative off-target-Effekte in vivo hervorruft, unterstreicht die Wichtigkeit eines effektiven Designs von siRNA-Sequenzen.

Recently, it has been shown that inhibition of gene expression in vitro by short interfering RNAs (siRNA) can induce the interferon pathway. Here, we demonstrate that a synthetic siRNA directed against beta-tubulin can concentration-dependent provoke an interferon response in adult rat central nervous system causing acute degeneration of neuronal cells. Following administration of siRNA or polyI:C, protein levels of both phosphorylated interferon inducible double stranded RNA-dependent protein kinase R and eukaryotic initiations factor 2 alpha were elevated. This response is associated with neuronal cell death in periventricular areas. Elevation of protein levels and the observed neurodegenerative changes were mostly reversed by application of the nonsteroidal antiinflammatory agent ibuprofen. The observation that siRNAs can induce neurodegenerative off-target-effects in vivo emphasizes the importance of an efficient design of siRNA sequences.