Transaktivierung des Epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors durch Angiotensin II in humanen Magenkarzinomzelllinien

Abstract

Einführung: Das Magenkarzinom liegt an zweiter Stelle der weltweit durch Tumorerkrankungen bedingten Todesfälle. Neue Kombinationen der bisherigen Chemotherapieformen konnten das Überleben nicht wesentlich steigern. Die Wissenschaft der letzten Jahre konzentriert sich daher auf die Suche nach, den Verlauf der Erkrankung vorhersagenden, Prognosemarkern. Diese können möglicherweise auch einen Angriffspunkt für neue Therapieformen darstellen. Der Epitheliale Wachstumsfaktorrezeptor (EGF-Rezeptor) spielt eine Schlüsselrolle in der Zellproliferation, der Zellinvasion und der Zellmigration. Seine Expression beträgt im Magenkarzinom bis zu 74%. Das Verständnis der Aktivierungsmechanismen des EGF-Rezeptors ist für das Verständnis von Tumorbiologie und den daraus resultierenden Therapiemöglichkeiten von großer Bedeutung, besonders in Verbindung mit möglichen Prognosemarkern. Die EGF-Rezeptoraktivierung verhindernde Tyrosinkinaseinhibitoren oder monoklonale Antikörper, wie beispielsweise Cetuximab und Panitumumab, ergänzen zunehmend die Tumortherapie. Auch für das Magenkarzinom wurden hier erste klinische Studien durchgeführt. In den letzten Jahren ist die lokale Expression des Angiotensinsystems (LAS) zunehmend prognostisch interessant geworden. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Angiotensin II Typ 1 Rezeptors (AT1R) mit dem Nodalstatus und dem UICC-Tumorstadium im Magenkarzinom vom intestinalen Typ korreliert. Der AT1R ist ein wichtiger G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR). Die Transaktivierung des EGF-Rezeptors durch GPCRs wurde bisher in verschiedenen Geweben untersucht165; 235. Es konnte gezeigt werden, dass an der EGF- Rezeptortransaktivierung membrangebundene Metalloproteasen, die sog. ADAMs (a disintegrin and metalloproteinase), beteiligt sein können. Sie spalten die Vorstufen der EGF-Rezeptorliganden. Wird der EGF-Rezeptor unter Aktivierung der ADAMs transaktiviert, wird das als Triple Membrane Passing Signal (TMPS) bezeichnet. Im Magenkarzinom konnte eine Überexpression von ADAM9, -12 und -15 nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde in den Magenkarzinomzelllinien MKN28, MKN45, AGS und N87 eine hohe Expression dieser Metalloproteasen gefunden. Ziel: In dieser Arbeit wurde die Hypothese einer Transaktivierung des EGF- Rezeptors durch Angiotensin II (Ang II) in den humanen Magenkarzinomzelllinien MKN28, MKN45, AGS und N87 untersucht. Damit sollte ein möglicher Weg der Beteiligung des LAS an der Kanzerogenese des Magenkarzinoms geprüft werden. Methoden: Um das EGF-Rezeptorprotein gezielt analysieren zu können, wurde die Methode der EGF-Rezeptorimmunpräzipitation (IP) etabliert. Die Expression des EGF-Rezeptors wurde mittels RT-PCR und Western Blot in den Magenkarzinomzelllinien MKN28, MKN45, AGS und N87 überprüft. Die Aktivierung des EGF-Rezeptors nach EGF- (25 bis 200 ng/ml) bzw. Ang II-Zugabe (10-6 bis 10-8 M) wurde alleine und in Kombination mit den Antagonisten AG1478, Olmesartan und PD123,319 in Zellkulturexperimenten untersucht. Die Auswertung erfolgte mithilfe von IP, SDS-PAGE, Western Blot, Immun¬färbung und Chemolumineszenz. Die Bildauswertung erfolgte mit der G-Box, der GeneSnap- Software und der GeneTools-Software. Für die statistische Auswertung wurde der Wilcoxon-Test für gepaarte Stichproben verwendet. Ergebnisse: Eine starke Expression des EGF-Rezeptors auf mRNA-Ebene und seine Expression auf Proteinebene konnten für alle untersuchten Zelllinien gezeigt werden. Die für den Nachweis der EGF-Rezeptorphosphorylierung etablierte Methode der IP war aufgrund zahlreicher Verarbeitungsschritte eine in der Praxis aufwendige und mit interexperi¬mentellen Schwankungen behaftete Methode. Mit der IP konnten im Rahmen dieser Arbeit folgende qualitative Aussagen gewonnen werden: Es konnte die Aktivierung des EGF-Rezeptors durch EGF für alle Zelllinien gezeigt werden. Die EGF-Rezeptortrans¬aktivierung durch Ang II konnte für die Zelllinien MKN28, AGS und N87 sicher belegt werden. In den Experimenten mit dem spezifischen EGF-Rezeptorinhibitor AG1478 konnte eine durch Ang II hervorgerufene Phosphorylierung am EGF-Rezeptor unter¬brochen werden. Zusätzlich konnte für MKN28 mithilfe von Olmesartan und PD123,319 gezeigt werden, dass die EGF-Rezeptortransaktivierung hauptsächlich über den AT1R erfolgt. Diskussion: Aufgrund der hohen Expression von ADAM9, -12 und -15 in den hier untersuchten Magenkarzinomzelllinien, ist eine EGF- Rezeptortransaktivierung durch Ang II über den Weg des TMPS sehr wahrscheinlich. Zur letztlichen Klärung sollten weitere Experimente, beispielsweise mit Metalloproteaseinhibitoren, durchgeführt werden. Die von AT1R ausgehende Ang II vermittelte EGF-Rezeptortransaktivierung stützt die bereits bestätigte Verbindung zwischen einer erhöhten AT1R-Expression und einer schlechteren Prognose im Magenkarzinom. Die von AT2R aktivierten Phosphatasen scheinen einen inhibierenden Effekt auf den EGF-Rezeptor auszuüben. Durch das Finden des Zusammenhangs von AT1R-Aktivierung und EGF- Rezeptor¬transaktivierung könnte die Inhibierung der Angiotensin II-Wirkung mit den bereits bekannten und eingesetzten Therapeutika zu einer hoffnungsvollen Ergänzung der aktuellen Magenkarzinomtherapie werden. Die Blockade der AT1R-Aktivierung durch direkte Rezeptorantagonisten oder ACE- Inhibitoren könnte damit in Kombination mit EGF-Rezeptorinhibitoren die bestehenden Therapieformen des Magenkarzinoms effektiv ergänzen.

Introduction: Gastric cancer ranks second worldwide among all death caused by tumors. New combinations of common chemotherapies have not been able to increase survival rates so far. In consequence, research is focusing on new prognostic markers. These may be able to predict the progression of gastric cancer and to possibly point to suitable targets for new therapies. The epidermal growth factor receptor (EGFR) plays a key role in cell proliferation, hypertrophy and migration. Its expression in gastric cancer was found to be up to 74%. Thus understanding the mechanisms leading to EGFR activation, is of high importance in the context of cancer biology and therapy strategies, especially in conjunction with possible prognostic markers. Tyrosinkinase inhibitors, which prevent activation of EGFR, or monoclonal antibodies, e.g. Cetuximab and Panitumumab, are increasingly a major component in contemporary cancer therapy. Some clinical trials with such agents have been conducted as well in respect to gastric cancer. In recent years, local expression of the angiotensin II system (LAS) has become increasingly of interest for the prognosis of gastric cancer. It has been shown that the expression of angiotensin II receptor type 1 (AT1R) is correlated with the N category and the UICC tumor stage. AT1R is an important G-protein-coupled receptor (GPCR). Transactivation of EGFR by GPCRs has been investigated in various tissues. It has been shown that in this process membrane anchored metalloproteinases, called ADAM (a disintegrin and metalloproteinase) can be involved. They cleave precursors of EGFR ligands. If EGFR is transactivated by involvement of ADAMs, the process is called triple membrane passing signal (TMPS). Overexpression of ADAM9, -12 and -15 has been found in gastric cancer. Additionally, a high expression of those ADAMs has been found in the gastric cancer cell lines MKN28, MKN45, AGS und N87. Subject and aim: The assumption of EGFR transactivation by angiotensin II (Ang II) in the gastric cancer cell lines MKN28, MKN45, AGS und N87 has been investigated in this dissertation. The aim was to investigate EGFR transactivation by Ang II as one potential way in which LAS can be involved in the progression of gastric cancer. Methods: To investigate EGFR protein, EGFR immunoprecipitation (IP) was established. Expression of EGFR in MKN28, MKN45, AGS und N87 was analyzed using RT-PCR and western blot. Activation of EGFR was investigated by addition of EGF (25 to 200 ng/ml) alone to cell culture or angiotensin II (10-6 to 10-8 M) respectively and in combination with the antagonists AG1478, Olmesartan and PD123,319. Cell culture experiments were evaluated by IP, SDS-PAGE, western blot and enhanced chemiluminescence (ECL). ECL pictures were analyzed using the G-Box, GeneSnap- und GeneTools-Software. Statistical analysis was performed using the Wilcoxon test for paired samples. Results: High Expression of EGFR mRNA and protein was found for all investigated cell lines. The IP method, which was established to examine EGFR phosphorylation, has proven to be laborious and prone to numerous experimental inaccuracies due to the excessive number of experimental stages. Through the use of the IP process, the following qualitative conclusions can be made in this dissertation: Activation of EGFR by EGF was shown for all cell lines. Transactivation of EGFR by Ang II has been verified for MKN28, AGS and N87. The specific EGFR inhibitor AG1478 was able to disrupt EGFR phosphorylation caused by Ang II. Additionally, EGFR transactivation in MKN28 occurred by activating AT1R, which was concluded from the experiments with Olmesartan and PD123,319. Discussion: Due to the high expression of ADAM9, -12 and -15 in the examined gastric cancer cell lines, transactivation of the EGFR according to the TMPS seems to be very likely. Further experiments should be performed, investigating this issue in the future, e.g. by using metalloproteinase inhibitors. EGFR transactivation by Ang II, which originates from AT1R activation, contributes to the previously observed connection between AT1R expression and a more negative prognosis as regards gastric cancer. The phosphatases, activated by AT2R, seem to have an inhibitory effect on EGFR. By finding a link between AT1R activation and EGFR transactivation, inhibition of the Ang II effect might become a promising addition to gastric cancer therapy by utilising the already used therapeutic agents. Inhibition of AT1R activation by direct receptor antagonists or ACE inhibitors might, especially in combination with EGFR inhibitors, complement gastric cancer therapy in an effective way.