Molecular Epidemiology of Brucellosis in Egypt, Diagnostic Procedures, Proteomics and Pathogenesis Studies

Abstract

Brucellosis is a zoonotic disease occurring worldwide in animals as well as in humans leading to huge economic losses. The infection is caused by Gram- negative bacteria of the genus Brucella. The disease is a very common in developing countries, but is often neglected. In Egypt, brucellosis was reported in a scientific report for the first time in 1939. Since then the disease emerged and remained endemic at high levels among ruminants, particularly in newly established large intensive breeding farms. The disease is prevalence nationwide in all farm animal species, in carrier hosts e.g. rats and in the environment. Serological investigations within the national surveillance program give indirect proof for the presence of brucellosis in cattle, buffaloes, sheep, goats and camels. Even though serologic assays for brucellosis are a well-established procedure but most of the corresponding studies still miss scientific standards. B. melitensis bv 3 and B. abortus bv 1 are the predominant isolates in Egypt and have been isolated from farm animals and Nile catfish. The epidemiologic situation of brucellosis in Egypt is complicated and needs clarification (Chapter 1). The disease is characterized by high morbidity but low mortality. However, the disease mainly transmitted via direct contact with infected animals, the most common way of infection is ingestion of contaminated milk or milk products and meat. DNA of B. melitensis was detected in milk samples that collected from apparently healthy animals’ produces milk for human consumption by molecular assays. The shedding of Brucella spp. especially the highly pathogenic species B. melitensis in milk poses an increasing threat to consumers and this is of obvious concern (Chapter 2). In endemic countries like Egypt, transmission of host specific Brucella spp. to nonpreferred hosts may occur due to the mixed rearing of farm animals. The interspecies transmission of B. melitensis from small ruminants to cattle and buffalo was reported. It is worth mentioning that, B. abortus DNA was identified in serum samples collected from aborted ewe and goats by real time PCR. This study is the first record on brucellosis caused by B. abortus in small ruminants in Egypt. Interestingly that, both B. abortus and B .melitensis. DNA was detected in one ovine serum. These results should be taken in consideration during implementation of control measures (Chapter 3). Among the 11 known Brucella spp., B. melitensis is the most virulent one and is the major causes of abortions in small ruminants. It causes also the severe form of human brucellosis. While, B. abortus infectious occurs in cattle preferably among cows. These two species having similar genomes, while are differences in host specificity and display different proteomes. A comprehensive identification of immunodominant proteins of these two species using antibodies present in the serum of naturally infected ruminants provided insight on the mechanism of their infection in different hosts. A number of heat shock proteins, binding proteins, enzymes, and hypothetical proteins were identified using western immunoblotting and MALDI- TOF MS/MS in both B. abortus and B. melitensis. Brucellae appear to express these proteins mainly for their survival in the host system during infection (Chapter 4). Diagnosis of brucellosis is still challenging in animals and humans and is based mainly on serology and isolation of Brucella. All serological tests have limitations concerning specificity and sensitivity. Cross-reactivity with other Gram-negative bacteria and within the species of the genus is the major hindrance for the specific serological diagnosis of brucellosis. The present study suggest a number of new immunogenic protein candidates of B. abortus and B. melitensis that had immunoreactivity against only sera collected from cattles, buffaloes, sheep and goats, respectively. Among of them five proteins, (Dihydrodipicolinate synthase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, lactate malate dehydrogenase, amino acid ABC transporter substrate-binding proteins, and fumarylacetoacetate hydrolase domaincontaining protein 2) have prominent immunogenic features. They may be cloned, purified and expressed in recombinant form to be used as specific antigen in serodiagnosis of brucellosis in the future. These proteins can be used to replace the classical LPS antigen preparation in Brucella serodiagnosis, will help to specify the causative species and will reduce false positive reactions resulting from cross-reaction with other Gram- negative bacteria (Chapter 5). Brucellae are intracellular stealthy pathogens causing disease in humans and in a wide range of domestic and wild animals. Rapid multiplication and cytoarchitectural damages induced in liver, kidney, lung, spleen, gastrointestinal tract, spinal meninges, yolk sac and chorioallantoic membrane after egg inoculation of B. microti in chicken embryos demonstrated the proliferation and pathogenicity of B. microti. This study provides the first results on the multiplication of the mouse pathogenic B. microti in chicken embryos and describes gross and histopathology associated with the infection. Our results suggest that, even though chicken are no mammals, they are useful tools to study the pathogenesis, pathogen interactions and immunopathology of brucellae (Chapter 6).

Brucellose ist eine weltweit vorkommende, zoonotische Erkrankung bei Tieren und Menschen und führt zu großen wirtschaftlichen Verlusten. Die Infektion wird durch Gramnegative Bakterien der Gattung Brucella verursacht. In Entwicklungsländern ist die Krankheit sehr häufig, wird aber oft vernachlässigt. In Ägypten wurde Brucellose erstmals 1939 in einem wissenschaftlichen Bericht erwähnt. Seitdem ist die Krankheit als endemisch einzustufen und die Fallzahlen bewegen sich bei Wiederkäuern auf hohem Niveau. Dies ist von besonderer Bedeutung in neu aufgebauten, großen Intensivzuchtbetrieben. Der Erreger kommt landesweit bei den meisten landwirtschaftlichen Nutztieren, in Vektoren wie z.B. Ratten und in der Umwelt vor. Serologische Untersuchungen im Rahmen des nationalen Surveillance- Programms wiesen Brucellose bei Rindern, Büffeln, Schafen, Ziegen und Kamelen nach. Obwohl serologische Assays für Brucellose gut etablierte Verfahren sind, sind die meisten dieser Studien bisher nicht nach den notwendigen wissenschaftlichen Standards durchgeführt worden. B. melitensis Biovar (bv) 3 und B. abortus bv 1 sind die vorherrschenden Pathovare in Ägypten und wurden aus Nutztieren und Nilwelsen isoliert. Die epidemiologische Situation der Brucellose in Ägypten ist auch auf Grund der vielen Kleinsthaltungen von landwirtschaftlichen Nutztieren schwierig einzuschätzen und bedarf der Klärung (Kapitel 1). Die Krankheit beim Menschen ist gekennzeichnet durch hohe Morbidität aber geringe Letalität. Die Krankheit wird vor allem über direkten Kontakt mit infizierten Tieren oder den Verzehr von kontaminierter Rohmilch oder Rohmilchprodukten und nicht ausreichend gegartem Fleisch übertragen. DNA von B. melitensis wurde in Milchproben, die von scheinbar gesunden Tieren stammten, mittels molekularbiologischer Testmethoden nachgewiesen. Die Ausscheidung von Brucella spp. vor allem der hochpathogenen Art B. melitensis in Milch stellt eine wichtige Bedrohung für die Verbraucher dar. (Kapitel 2). In endemischen Ländern wie Ägypten ist der möglichen Übertragung von wirtsspezifischen Brucella spp. auf ansonsten nicht präferierte Wirte durch die häufig gemischte Haltung von Nutztieren besondere Beachtung beizumessen. Beispiele sind die Übertragung von B. melitensis von kleinen Wiederkäuern auf Rinder und Büffel. Mittels Real-Time PCR konnte B. abortus DNA in Serumproben von Ziegen und Schafen nach Aborten nachgewiesen werden. Damit gelang der erste Nachweis von „Rinderbrucellose“ bei kleinen Wiederkäuern in Ägypten. Interessanterweise wurde B. abortus und B. melitensis DNA in ein und demselben Schafserum nachgewiesen. Die Möglichkeit einer solchen Parallelinfektion sollte bei der Durchführung von Kontrollmaßnahmen berücksichtigt werden (Kapitel 3). Unter den bisher 11 bekannten Brucella spp. ist B. melitensis die am höchsten virulente Spezies für den Menschen und gilt als wichtigster Aborterreger bei kleinen Wiederkäuern. Dagegen infiziert B. abortus vor allem Rinder und spielt bei Milchkühen eine große Rolle. Diese beiden Brucella-Arten haben ähnliche Genome, aber unterschiedliche Proteome und weisen verschiedene Wirtspräferenzen auf. Eine umfassende Identifizierung immundominanter Proteine dieser beiden Bakterienspezies unter Nutzung von Antiseren natürlich infizierter Wiederkäuer gibt einen Einblick in den Infektionsverlauf bei unterschiedlichen Wirten. Eine Reihe von Hitze-Schock-Proteinen, sogenannte binding Proteins, Enzyme und hypothetische Proteine wurden mittels Immunoblotting (Western-Blot) und MALDI-TOF MS/MS bei B. abortus und B. melitensis identifiziert. Brucellen scheinen diese Proteine während der Infektion für ihr Überleben im Wirtsorganismus zu exprimieren (Kapitel 4). Die Diagnose der Brucellose bei Tier und Mensch stellt immer noch eine Herausforderung dar und basiert im Wesentlichen auf serologischen Methoden und Erregerisolierung. Alle serologischen Tests haben Einschränkungen hinsichtlich Spezifität und Sensitivität. Die Kreuzreaktivität mit anderen gramnegativen Bakterien und innerhalb der Arten der Gattung Brucella stellt ein großes Problem für die serologische Diagnose der Brucellose dar. Die vorliegende Studie beschreibt eine Reihe von immunogen Kandidatenproteinen von B. abortus und B. melitensis, die eine Immunreaktivität nur gegen seropositiven Proben von Rindern, Büffel, Schafen und Ziegen zeigten. Unter ihnen sind fünf Proteine (Dihydrodipicolinate-Synthase, Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase, Laktat-Malat-Dehydrogenase, Aminosäure-ABC-Transporter- Substrat-bindende Proteine und Fumarylacetoacetate Hydrolase Domäne-haltiges Protein 2), mit wichtigen immunogen Eigenschaften, die kloniert, gereinigt und in rekombinanter Form exprimiert werden könnten, um sie als spezifische Antigene in der serologischen Brucellose-Diagnostik verwenden zu können. Diese Proteine könnten klassische LPS Antigen-Präparationen ersetzen und durch ihre höhere Spezifität falsch positive serologische Reaktionen einschränken (Kapitel 5). Brucellen sind intrazelluläre Pathogene, die Erkrankungen beim Menschen und bei einer Vielzahl domestizierter und von Wildtieren verursachen. Die experimentelle Inokulation von Hühnerembryonen mit B. microti könnte ein in ovo Modell sein, um die Interaktion zwischen Erreger und Wirtszellen zu erforschen. Die schnelle Vermehrung des Erregers und pathologische Veränderungen in Leber, Niere, Lunge, Milz, Magen-Darm-Trakt, spinalen Meningen, Dottersack und Chorioallantoismembran nach Inokulation von B. microti in embryonierte Hühnereier demonstrierte die Ausbreitung und Pathogenität dieser Spezies in Hühnerembryonen. Die vorliegende Studie beschreibt somit erstmals die Vermehrung von mauspathogenen B. microti in Hühnerembryonen und die pathologisch-anatomische und histopathologische Veränderungen, die mit der Infektion assoziiert sind. Unsere Daten legen nahe, dass, obwohl Hühner keine Säugetiere sind und bisher nicht als Wirtstiere für Brucellen galten, das Hühnerembryonenmedell, geeignet ist, Untersuchungen zur Pathogenese, Pathogen-Wirtsinteraktion und Immunpathologie der Brucellen durchzuführen (Kapitel 6).