Charakterisierung von cis- und trans-Faktoren der transkriptionellen Cytokininantwort in Arabidopsis thaliana

Abstract

In Pflanzen kontrollieren Phytohormone, zu denen auch Cytokinin zählt, viele Prozesse des Wachstums und der Entwicklung. Unter anderem ist Cytokinin an der Meristementwicklung von Spross und Wurzel, der Blattseneszenz sowie der Chloroplastenentwicklung beteiligt. In dieser Promotionsarbeit sollten zunächst cis-regulatorische Elemente identifiziert werden, die für die Cytokininsignalweiterleitung wichtig sind. Mit Hilfe von Promotordeletionsanalysen von bereits vorhandenen Fragmenten des Typ-A ARR Gens ARR6 konnte im Protoplast-trans-Aktivierungssystem (PTA) ein 27 bp langes DNA-Fragment identifiziert werden, welches einen Teil der Cytokininantwort vermittelt. Nach der erfolgreichen Expression und Aufreinigung der DNA- Bindedomäne (DBD) des Typ-B ARR ARR1 in E. coli konnte durch Gelretardationsas-says gezeigt werden, dass GST:ARR1-DBD nicht an dieses DNA- Fragment binden kann. In weiteren Analysen des ARR6-Promotors wurde mit Hilfe des yeast one-hybrid-Systems nach trans-Faktoren gesucht, die an das 27 bp- DNA-Fragment binden können. Unter anderem konnte mit diesem System eine Transaktivierung des Promotors von ARR6 durch das LIGHT SENSITIVE HYPOCOTYL 3 (LSH3) gezeigt werden. Trotz der fehlenden Bindung von LSH3 in vitro wurde ein reprimierender Effekt auf die Transaktivierungskapazität von ARR1 in vivo nachgewiesen, der durch Zugabe von Cytokinin teilweise revertiert werden konnte. In Tabak-epidermiszellen transient exprimierte LSH3:GFP- Fusionsproteine zeigten eine Lokalisation im Zellkern. Analysen von LSH3 überexprimierenden Pflanzen zeigten eine signifikant geringere Anzahl an Lateralwurzeln im Vergleich zum Wildtyp. Des Weiteren konnte eine schlechtere Keimungsrate der Überexprimierer auf Medium mit Paclobutrazol, einem Inhibitor der Gibberel-linbiosynthese, observiert werden. Die Überexpression von LSH3 im arr10arr12-Doppelknockout resultierte in Pflanzen mit starkem Zwergwuchs, der stark dem Phänotyp der arr1arr10arr12-Dreichfachmutante ähnelte. Eine Analyse der Transkriptmengen von ARR1 in den LSH3-Überexprimierern deutete auf einen posttranskriptionellen Regulationsmechanismus von LSH3 hin. Protein-Protein- Interaktionsstudien mit dem yeast two-hybrid-System und Ko-Immunopräzipitation konnten allerdings keinerlei Interaktionen von LSH3 mit den Typ-B- bzw. Typ-A ARR nachweisen. Yeast two-hybrid-Untersuchungen identifizierten den Transkriptionsfaktor WRKY6 als Inter-aktionspartner von LSH3. Weitergehende Analysen zeigten ebenfalls eine Interaktion von WRKY6 mit ARR1. PTA-Analysen zur Funktion von WRKY6 zeigten keine Veränderung der Transaktivierungskapazität von ARR1 ohne Zugabe von Cytokinin. Allerdings konnte die LSH3-abhängige Reprimierung der Transaktivierungskapazität von ARR1 durch die Expression von WRKY6 aufgehoben werden. Nach der Induktion mit Cytokinin resultierte die Expression von WRKY6 in einem positiven Effekt auf die Transaktivierungskapazität von ARR1. Dieser Effekt wurde durch die Koexpression von LSH3 noch weiter verstärkt.

Phytohormones have a great impact on plant growth and development. Cytokinins are one phytohormone class which is involved in the development of the shoot and root meristem, the leaf senescence and the development of chloroplasts. An aim of this thesis has been the identification of potential cis-regulatory elements involved in the cytokinintransduction. Promoter deletion analysis of the type-A ARR gene ARR6 in protoplast-trans-activation assays (PTAs) identified a 27 bp long DNA-fragment which mediates part of the cytokinin signal. After expression and purification of the DNA-binding domain of ARR1 in E. coli it was shown that GST:ARR1-DBD could not bind to the 27 bp DNA- fragment in vitro. Yeast one-hybrid screens with the promoter of ARR6 should identify potential trans-factors for the 27 bp fragment. Among others these screens identified Light Sensitive Hypocotyl 3 (LSH3). Despite the lack of binding to the ARR6 promoter in gel shift assays it could be shown that LSH3 represses the transactivation capacity of ARR1 in vivo and that this effect can be reverted by application of exogenous cytokinin. In tobacco leafs transiently expressed GFP-fusions showed a nuclear localization for LSH3. Overexpressors of LSH3 resulted in plants with a reduced number of lateral roots and a strongly impaired germination on media containing paclobutrazole, an inhibitor of gibberellin synthesis. The overexpression of LSH3 in the background of the arr10arr12 mutant resulted in dwarfed plants which resemble the arr1arr10arr12 phenotype. Analysis of the ARR1 transcript level in the LSH3 overexpressors points toward a regulatory mechanism for LSH3 at the posttranscriptional level. Protein-protein interaction studies with the yeast two-hybrid system and co-immunoprecipitation assays showed no interaction between LSH3 and any of the type-B nor type-A ARR. Yeast two-hybrid studies identified the transcription factor WRKY6 as an interaction partner for LSH3 and ARR1. Functional studies for WRKY6 in PTA experiments showed no effect on the transcriptional capacity of ARR1 without cytokinin. However, overexpression of WRKY6 could completely reverse the negative effect on the ARR1 transactivation capacity caused by LSH3. After induction with cytokinin the WRKY6 expression resulted in an increased transactivation of the ARR6 promoter by ARR1. This effect was even stronger when LSH3 was coexpressed with WRKY6 and ARR1.