1\. We presented the purification of rat CD26/DPPIV and elucidation of its three-dimensional structure by cryo-TEM. Homogenous dimeric rat CD26 with enzyme activity was purified by two-step chromatography, mAb-conjugated affinity chromatography and SE-FPLC. Its structure was determined by cryo-TEM and single particle analysis at a resolution of ~14 Å. The reconstruction confirms that the protein exists as a dimer, as predicted earlier. Since there are structural analogies to the serine peptidase prolyl oligopeptidase (POP), docking calculations of the two structures were performed. Although the docking showed a similar spatial organization (catalytic domain, b-propeller, distal opening, central cavity) the detailed comparison revealed clear discrepancies. The most marked difference is a second (lateral) opening in CD26/DPPIV, which would enable direct access to the catalytic site. We therefore assume that substrate selectivity and binding rate are most probably driven by different mechanisms in CD26/DPPIV and POP. 2\. In order to investigate the role of CD26 in the immune system, CD26 gene knockout mice with C57BL/6 background were used to study the immune response after stimulation with PWM and with ovalbumin, respectively. CD26-/- mice display an apparently normal phenotype. But in their spleen lymphocyte population, the percentage of CD4+ T cells is lower and that of NK cells is higher than in CD26+/+ mice. In their peripheral blood, CD26-/- mice presented a conspicuously decreased proportion of CD4+ NKT lymphocytes. In vitro, compared with CD26+/+ mice, the PWM-stimulated IL-4 production in CD26-/- mice was decreased by 60 ? 80% in the supernatants of spleen lymphocytes, whereas the production of IL-10 and IFN-g was increased. No significant differences were found in the production of IL-2, IL-5, IL-6 and IL-13 between deficient and wild type mice. After immunization of mice with PWM in vivo, serum concentrations of total IgG, IgG1, IgG2a and IgE were markedly lower in CD26-/- mice than those in CD26+/+ mice, while no difference was found in IgM production. Further analysis of cytokine concentrations in vivo revealed that a reduced IL-4, IL-2 and delayed IFN-g production in sera of CD26-/- mice contributed to the decrease of PWM-induced immunoglobulin production. After ovalbumin immunization in vivo, both IgM and IgG (total IgG and subclasses IgG1 and IgG2a) production were lower in CD26-/- mouse. The difference of IgG production between two strains was obvious. But IgE production was not affected. Aerosol challenge with OVA resulted in a much more severe eosinophilia and inflammation in the lung of CD26-/- mice, which was caused by markedly increased local Th2 cytokines IL-4, IL-5 and IL-13. These results indicate that CD26 contributes to the regulation of development, maturation and migration of CD4+T, NK and NKT cells, of cytokine secretion, of T-cell dependent antibody production and immunoglobulin isotype switching of B cells. Its expression in the lung is crucial for regulation of allergen-mediated eosinophilia and local inflammation.
1\. In der vorliegenden Arbeit stellen wir die Reinigung der CD26/DPPIV und die Klärung der dreidimensionalen Struktur durch cryo-TEM dar. Durch eine zweistufige Reinigung, mAb-Affinitätschromatographie und SE-FPLC, konnte CD26/DPPIV in hoher Reinheit als enzymatisch aktives Dimer hergestellt werden. Die 3D-Struktur der dimeren CD26/DPPIV wurde durch cryo-TEM und der 'single particle' Methode rekonstruiert und mit einer Auflösung von 14 Å ermittelt. Die Rekonstruktion der ermittelten strukturellen Daten ergab, das es sich bei den erhaltenen Partikeln um Dimere handelt, wie vorher durch SE-FPLC gezeigt. Da die CD26/DPPIV strukturelle Analogien zur Serinpeptidase Prolyl- Oligopeptidase (POP) besitzt, deren Struktur bekannt ist, wurden 'docking'-Kalkulationen durchgeführt und verglichen. Diese Berechnungen zeigten eine hohe Ähnlichkeit der Strukturen von POP und CD26/DPPIV. So konnten Ähnlichkeiten im katalytischen Zentrum, b-Propeller, distaler Öffnung und zentraler Höhle gefunden werden. Im Unterschied zur POP zeigte die Struktur der CD26/DPPIV jedoch eine zweite Öffnung im distalen Bereich, die einen direkten Zutritt zum katalytischen Zentrum ermöglichen könnte. Auf Grund dieses strukturellen Unterschiedes, ergeben sich die unterschiedlichen Substratspezifitäten und Bindungskonstanten der beiden Proteasen. 2\. Um die Funktionen der CD26/DPPIV im Immunsystem zu ermitteln, wurden CD26 knock-out Mäuse des Typs C57BL/6 verwendet. Die Immunantwort von CD26-/- Mäusen wurde nach Anregung mit PWM und Ovalbumin im Vergleich mit CD26+/+ Mäusen untersucht. CD26-/- Mäuse zeigen einen normalen Phänotyp. Untersuchungen der Milz-Lymphozytenpopulation zeigten jedoch eine verringertes Vorkommen von CD4+ T-Zellen und ein erhöhtes Auftreten von NK-Zellen, im Vergleich mit CD26+/+ Mäusen. Auch im peripheren Blut zeigte sich eine auffallend verringerte CD4+ NKT-Zellen-Population. In in vitro Studien mit kultivierten Milz-Lymphozyten wurden Zytokinmessungen nach PWM-Stimulation durchgeführt. Dabei zeigte sich eine um 60-80% verringerte IL-4 Sekretion in CD26-/- Kulturen, während die Sekretion von IL-10 und IFN-g erhöht war. Keine Unterschiede bezüglich der Zytokin-Sekretion konnten für IL-2, IL-5, IL-6 und IL-13 gefunden werden. Wurden die Mäuse mit PWM immunisiert, so zeigte sich in CD26-/- Mäusen eine verringerte Antikörperproduktion. Die Serumkonzentrationen von Gesamt -IgG, -IgG1, -IgG2a und -IgE waren signifikant niedriger als in immunisierten CD26+/+ Mäusen, während kein Unterschied in der IgM-Produktion festgestellt werden konnte. Zytokinmessungen im Serum von immunisierten Mäusen zeigten ein verringertes IL-4 und IL-2 Vorkommen in CD26-/- Mäusen und eine zeitliche Verzögerung der IFNg-Produktion, was zur Verringerung des Immunoglobulin- Spiegels in CD26-/- Mäusen beitragen kann. Nach Immunisierung der Mäuse mit Ovalbumin waren in den CD26-/- Tieren die Konzentrationen von IgM, IgG (Gesamt-IgG, -IgG1 und -IgG2a) verringert, während keine Unterschiede in der IgE-Konzentration messbar waren. OVA-Administration als Aerosol resultierte in einer Entzündungreaktion in den Lungenflügeln von CD26+/+ und CD26-/- Mäusen. Die Entzündung in CD26-/- Mäusen war im Vergleich mit dem CD26+/+ Mäuse wesentlich verstärkt und begleitet von einer verstärkten Eosinophilie im entzündeten Gewebe. Desweiteren konnte im Gewebe von CD26-/- Mäusen eine erhöhte Konzentration von IL-4, IL-5 und IL-13 gemessen werden. Diese Th2-Zytokine könnten zur Verstärkung der Entzündung führen. Diese Befunde zeigen eine Beteiligung der CD26/DPPIV bei der Reifung, Aktivierung und Migration von CD4+ T-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, eine Beteiligung bei der Zytokin-Sekretion von T-Zellen und bei der Antikörperproduktion, bzw. des Isotypenwechsels bei der B-Zell Reifung. CD26/DPPIV in Lunge ist wichtig für die Regulation der Allergen-vermittelten Eosinophilie und der Lokalentzündung.