Vergleich von zwei Methoden zur Detektion aktivierender BRAF V600-Mutationen im malignen Melanom

Abstract

Einleitung: Die molekulargenetische Analyse von Tumorgewebe ist von wachsender Relevanz für die onkologische Forschung, Diagnostik und Therapie. Aktivierende Mutationen des BRAF-Gens im malignen Melanom können zielgerichtet therapiert werden und werden daher auch in der molekularpathologischen Routine-Diagnostik untersucht. Zur Bestimmung des BRAF-Mutationsstatus werden aktuell vor allem die Pyrosequenzierung sowie in größeren Einrichtungen auch neuere, jedoch vergleichsweise aufwendigere parallele Sequenzierverfahren verwendet. Schnellere und einfachere Analysemethoden könnten die Mutationsdiagnostik dezentralisieren und einen eventuellen Therapiebeginn beschleunigen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein solches neuartiges PCR-basiertes Verfahren zur BRAF-Mutationsdiagnostik an Gewebeproben maligner Melanome getestet und mit der Pyrosequenzierung verglichen. Methodik: 249 Formalin-fixierte, Paraffin- eingebettete Gewebeproben von malignen Melanomen wurden einerseits mit einer automatischen Methode, basierend auf einer Echtzeit-PCR mittels Amplification- refractory-mutation-system-(ARMS)-Primern, (Idylla, Biocartis), andererseits mittels Pyrosequenzierung (therascreen BRAF Pyro Kit, Qiagen) analysiert. Die Ergebnisse der Mutationsanalysen beider Methoden wurden miteinander verglichen und zu klinisch-pathologischen Parametern in Beziehung gesetzt. Abweichende Ergebnisse wurden zusätzlich mit Panel-basierter Sequenzierung (Ion Torrent, Life Technologies) untersucht. Ergebnisse: 236 Proben lieferten mit beiden Methoden technisch valide Ergebnisse, davon zeigten 231 Proben (97,9%) ein übereinstimmendes Ergebnis. In den übrigen fünf Fällen detektierte die Idylla- Methode eine Mutation, während die Pyrosequenzierung einen Wildtyp zeigte. Die Reanalyse dieser Proben mittels Panel-Sequenzierung bestätigte in drei Fällen das mutationspositive Ergebnis der Idylla-Analyse. Im vierten Fall konnte die von Idylla detektierte Mutation auf ein Fixierungsartefakt zurückgeführt werden, im fünften Fall zeigten sich nach Überprüfung und Korrektur eines initial fehlerhaft ausgewählten Gewebeareals keine abweichenden Ergebnisse mehr. Insgesamt zeigten 43,8% der Tumoren eine der untersuchten BRAF V600-Mutationen. Hierbei wiesen jüngere Patienten (= 59 Jahre) mit 52,7% zu einem signifikant höheren Anteil BRAF-Mutationen auf als ältere Patienten (= 60 Jahre) (37,4%). Der Anteil an BRAF-Mutationen vom Typ V600E lag bei insgesamt 84,7% und nahm mit steigendem Alter ab. Diskussion: Die Idylla- Methode funktionierte zuverlässig, zeigte eine höhere Sensitivität als die Pyrosequenzierung und ließ sich einfach und schnell durchführen. Allerdings wird die Mutationsfrequenz innerhalb eines Tumors nicht ermittelt. Dies ist zurzeit zwar ohne klinische Konsequenz, könnte in Zukunft jedoch eine Einschränkung bedeuten, sofern sich in klinischen Studien unterschiedliche Ansprechraten in Abhängigkeit von der Mutationsfrequenz zeigen. Trotz der steigenden Verbreitung von parallelen Sequenzierungstechniken bleibt der Vorteil des Idylla-Verfahrens der im Vergleich deutlich geringere Zeit- und Arbeitsaufwand, wodurch sich der Einsatz auch für kleinere Laboreinrichtungen eignet. Fazit: Die Idylla-Methode ist eine im Vergleich zur Pyrosequenzierung sensitivere, schnellere und einfacher durchzuführende Möglichkeit zur Detektion aktivierender BRAF V600-Mutationen und damit für den Routineeinsatz auch außerhalb von Speziallaboren geeignet.

Background: Molecular pathological analyses of tumor tissue are of increasing relevance to oncological research, diagnostics and therapy. Activating BRAF V600 mutations in malignant melanoma can be targeted therapeutically and are therefore examined in routine molecular pathology. At present, BRAF mutation status is predominantly determined through pyrosequencing, whereas larger labs also apply novel, but more costly parallel sequencing methods. Faster and easier methods to determine mutations could enable also smaller labs to perform testing and expedite the beginning of a potential treatment. Here, we test a novel PCR-based method for BRAF mutation analysis with malignant melanoma tissue samples and compare it to pyrosequencing. Methods: 249 formalin-fixed, paraffin-embedded malignant melanoma tissue samples were analyzed by an automated method that relies on amplification-refractory- mutation-system (ARMS) primers (Idylla, Biocartis) on one hand, and by pyrosequencing (therascreen BRAF Pyro kit, Qiagen) on the other. Technically valid results for both methods (236 samples) were compared and correlated with clinicopathological parameters. Discordant results were further analyzed with next-generation panel-sequencing (Ion Torrent, Life Technologies). Results: Agreement between Idylla and pyrosequencing was reached in 231 out of 236 samples (97.9%). The five discrepant samples showed a BRAF mutation with Idylla and a wildtype sequence with pyrosequencing. Reanalysis of these samples by panel-sequencing confirmed the Idylla result in 3 cases. In the 4th case the mutation detected by Idylla was determined to be a fixation artifact. For the 5th case a review of the selected tissue region prompted a reanalysis yielding a concordant result. In total, 43.9% of tumors showed BRAF V600 mutations. Younger patients (= 59 years) had a significantly higher proportion of BRAF mutations than older patients (= 60 years) (52.7% vs. 37.4%). The overall proportion of V600E mutations was 84.7% and decreased with older age. Discussion: The Idylla method worked reliably and fast and was more sensitive in detecting BRAF V600 mutations than pyrosequencing. However, Idylla does not provide mutation frequencies. While this has no immediate clinical consequences, it may be a limitation in the future, in case clinical studies show different response rates depending on mutation frequency. Despite the increasing use of parallel sequencing methods, the advantage of Idylla is its ease-of-use, speed and the suitability even for smaller labs. Conclusion: Compared to pyrosequencing the PCR-based Idylla method is a more sensitive, faster and easier approach to detect activating BRAF V600 mutations in FFPE- tissue samples and is therefore suitable for routine use also beyond specialized laboratories.