Single-cell transcriptome analysis of metabolic stress response in macrophages

Abstract

Obesity-induced metabolic disorders and type 2 diabetes have become global burden in the last decades causing a number of deaths and significant social and economical damage. Chronic inflammation underlies obesity-induced development of insulin resistance, cardiovascular disease and metabolic syndrome. Chronic inflammation is mainly caused by increased accumulation and activation of various immune cells in obese tissues. Macrophages play a particularly important role in the development of this pathological process. Previous studies described pro-inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophage states and the role of imbalance between M1 and M2 macrophages in the development of chronic inflammation. However, growing evidence of macrophage diversity in health and disease requires more accurate analysis of macrophage molecular phenotypes. In this study we used single-cell transcriptome analysis of macrophages, stimulated with high levels of FFAs typical for obese adipose tissue microenvironment. Analyzing full transcriptomes of individual cells, we were able to distinguish 3 macrophage transcriptional states and decipher gene regulatory pathways underlying macrophage state identity. We also quantified the level of cell-to-cell variability for different pathways and gene co-expression modules to distinguish highly robust and “noisy” molecular mechanisms. These results can be used for further gene perturbation experiments to better understand their role in macrophage response to metabolic stimulation. We show that pro-and anti-inflammatory genes and pathways act in a mutually exclusive way in distinct macrophage states. We identified ATF3 as one of the important transcription factor, suppressing fatty acids-induced inflammation, to be expressed in a mutually exclusive manner with inflammatory mediator genes such as IL1β. The results obtained for well-controlled isogenic THP-1 macrophages were validated using primary human macrophages. Overall, our findings demonstrate that macrophages form distinct states in response to stress and the ratio between cell states seems crucial for homeostasis regulation. Our results contain valuable information of highly correlating gene modules, specifically expressed in distinct cell states as well as information about newly described genes in such context. These findings represent a valuable resource for future studies of molecular mechanisms of obesity-induced insulin resistance and type 2 diabetes.

Stoffwechselstörungen und Typ-2-Diabetes infolge von Fettleibigkeit sind in den letzten Jahrzehnten zu einer globalen Belastung geworden und für eine Reihe von Todesfällen sowie soziale und wirtschaftliche Schäden verantwortlich. Chronische Entzündungen spielen bei der durch Fettleibigkeit induzierten Entwicklung von Insulinresistenz sowie bei der Entstehung der Herz-Kreislauf-Erkrankung und des metabolischen Syndroms eine entscheidende Rolle. Chronische Entzündungen werden hauptsächlich durch eine erhöhte Ansammlung und Aktivierung verschiedener Immunzellen im Fettgewebe verursacht. Makrophagen spielen bei der Entwicklung dieses pathologischen Prozesses eine besonders wichtige Rolle. In früheren Studien wurden pro-inflammatorische M1- und anti-inflammatorische M2-Makrophagen-Zustände sowie die Rolle des Missverhältnisses zwischen M1- und M2-Makrophagen im Rahmen der Entwicklung chronischer Entzündungen beschrieben. Allerdings wird im Hinblick auf die Bereiche Gesundheit und Krankheit durch die zunehmenden Hinweise auf Makrophagen-Diversität eine genauere Analyse der molekularen Phänotypen von Makrophagen erforderlich. In dieser Studie führten wir eine „Einzelzelle- Transkriptom-Analyse“ von Makrophagen durch, stimuliert mit einer hohen Menge FFAs, die für die Mikroumgebung des Fettgewebes bei fettleibigen Personen typisch sind. Durch die Analyse von kompletten Transkriptomen individueller Zellen waren wir in der Lage, drei transkriptionelle Makrophagen-Zustände zu differenzieren und Gen-regulierende Bahnen, die der Identität von Makrophagen- Zuständen zugrunde liegen, zu entschlüsseln. Außerdem ist es uns gelungen, das Maß der Zelle-zu-Zelle-Variabilität der verschiedenen Bahnen sowie die Module der Co-Expression der Gene zu quantifizieren, um besonders stabile und "laute" molekulare Mechanismen zu differenzieren. Diese Ergebnisse können für weitere Versuche zur Gen-Perturbation genutzt werden, um deren Rolle bei der Makrophagen-Reaktion auf Anregung des Stoffwechsels besser zu verstehen. Wir zeigen, dass pro- und anti-inflammatorische Gene und Bahnen in sich einander ausschließender Weise in verschiedenen Makrophagen-Zuständen wirken. Als einen der bedeutenden Transkriptionsfaktoren haben wir ATF3 identifiziert - dieser unterbindet die durch Fettsäuren induzierten Entzündungen, wobei in sich einander ausschließender Weise mit inflammatorischen Mediator-Genen wie zum Beispiel IL1β exprimiert wird. Die Ergebnisse, die im Hinblick auf gut kontrollierte, isogene THP-1-Makrophagen ermittelt worden sind, wurden mithilfe primär menschlicher Makrophagen validiert. Insgesamt zeigen unsere Erkenntnisse, dass Makrophagen als Reaktion auf Stress unterschiedliche Zustände annehmen, während das Verhältnis zwischen den Zuständen der Zellen für die Homöostase-Regulierung von zentraler Bedeutung zu sein scheint. Unsere Ergebnisse umfassen wertvolle Informationen zu in hohem Maße korrelierenden Gen-Modulen, die speziell in verschiedenen Zellzuständen exprimiert werden, sowie außerdem in diesem Zusammenhang Informationen zu neu beschriebenen Genen. Im Hinblick auf zukünftige Studien an molekularen Mechanismen von Insulinresistenz und Typ-2-Diabetes aufgrund von Fettleibigkeit stellen diese Erkenntnisse eine wertvolle Ressource dar.