Mechanistische Aspekte der Evolution von Lipoxygenasen

Abstract

Einleitung: Lipoxygenasen (LOXn) bilden eine Familie lipidperoxidierender Enzyme, die bei Pflanzen und Tieren weit verbreitet vorkommen, zu deren biologischer Funktion es jedoch noch kein allgemein gültiges Konzept gibt. In der vorliegenden Arbeit wurden ausgewählte Aspekte der Evolution von LOXn untersucht, wobei folgende Fragen beantwortet werden sollten: 1. In welcher Verbreitung kommen LOXn in den drei Domänen des irdischen Lebens (Bakterien, Archaeen, Eukaryonten) vor? 2. Besitzt der Zebrafisch, der als Modellorganismus für frühe Vertebraten angesehen wird, eine funktionelle ALOX5 und einen intakten Leukotriensignalweg? 3. Gab es eine systematische Evolution der Reaktionsspezifität der ALOX15 im Laufe der späten Primatenentwicklung von 12- zu 15-lipoxygenierenden Isoformen? 4. Exprimierten die ausgestorbenen menschlichen Vorfahren (H. neanderthalensis und H. denisovan) funktionsfähige LOXn und andere Enzyme und Rezeptoren der Leukotriensignaltransduktion? Methodik: Um das Vorkommen von LOXn in ausgewählten Organismen zu erforschen, welche die Entwicklung der Lebewesen auf verschiedenen Evolutionsniveaus repräsentieren, wurden Genomdatenbanken mit speziellen Suchstrategien auf das Vorkommen von LOX-Genen untersucht und die Eigenschaften der rekombinanten Enzyme unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese charakterisiert. Ergebnisse: 1. LOXn kommen in < 1% der sequenzierten bakteriellen Genome vor. In Archaeen wurden bisher keine funktionellen LOX-Gene nachgewiesen. 2. Das Zebrafischgenom enthält mehrere LOX-Gene. Das Gen mit der höchsten Sequenzhomologie zur humALOX5 kodiert für eine funktionelle ALOX5, die durch Mutagenese in eine 15-lipoxygenierende Enzymspezies umwandelbar ist. Phosphorylierungsmimetische Mutanten verändern nicht die Reaktionsspezifität dieses Enzyms. 3. Im Laufe der späten Primatenenevolution kam es zu einer Veränderung der Reaktionsspezifität der ALOX15 (12-lipoxygenierend bei niederen Primaten, 15-lipoxygenierend bei höheren Primaten), wobei die Gibbon- ALOX15 eine Übergangsform mit ausgeprägter dualer Reaktionsspezifität darstellt. Als evolutionäre Triebkraft dafür kann die Optimierung der Membranoxygenase- und der Lipoxinsynthaseaktivität angesehen werden. 4. Im Genom ausgestorbener Frühmenschen (H. neanderthalensis, H. denisovan) konnten intakte Gene für alle wichtigen Enzyme und Rezeptoren der Leukotriensignalkaskade nachgewiesen werden. Detaillierte Sequenzvergleiche und Mutageneseuntersuchungen belegen deren Funktionalität. Schlussfolgerungen: Trotz der großen Verbreitung von LOXn in höheren Lebewesen sind diese Enzyme in Bakterien nur spärlich vorhanden und wurden in Archaeen bislang nicht nachgewiesen. Diese Daten sprechen dafür, dass es bei primitiven Lebewesen keine systematische Evolution von LOXn gegeben hat, sondern dass die Enzyme durch horizontalen Gentransfer sporadisch ins Genom niederer Organismen eingeführt wurden. Auf der Grundlage der derzeit verfügbaren Daten lässt sich der Beginn einer systematischen LOX-Evolution und die Einführung des Leuoktriensignalweges bei höheren Lebewesen nicht sicher datieren. Einen funktionellen Leukotriensignalweg gab es jedoch bereits beim Zebrafisch, was auf deren Existenz bei Knochenfischen im Allgemeinen hindeutet.

Introduction: Lipoxygenases (LOXn) form a family of lipid peroxidizing enzymes, which are widely distributed in plants and animals. Unfortunately, there is no unifying concept for their biological role. Here, selected aspects of LOX evolution were explored and the following questions were addressed: 1. How frequently do LOXs occur in the three domains of terrestrial life (bacteria, archaea, eucarya)? 2. Does the zebrafish, which is a vertebrate model organism, exhibit functional leukotriene signaling? 3. Was there a targeted change in the reaction specificity of ALOX15-orthologs during late primate evolution form 12- to 15-lipoxygenating enzymes? 4. Did extinct human subspecies (H. neanderthalensis, H. denisovan) express functional ALOX5-orthologs and other constituents of leukotriene signaling? Methodology: To explore the existence of LOXs in selected organisms representing different evolutionary levels, we searched genomic databases for the presence of true LOX-genes employing specially designed screening strategies and characterized selected recombinant enzymes employing site-directed mutagenesis. Results: LOXs occur in < 1% of all bacterial genomes but no true LOX sequences have been detected in archaea. 2. The zebrafish genome involves several LOX genes and one of them encodes for a functional zbfALOX5. This enzyme can be converted to a 15-lipoxygenating LOX by site-directed mutagenesis of its triade determinants. Phosphorylation mimicking mutations did not alter the reaction specificity of zbfALOX5. 3. During late primate evolution there was an evolutionary switch in the reaction specificity of ALOX15-orthologs (12-lipoxygenting in lower primates, 15-lipoxygenating in higher primates) and gibbons express an ALOX15 with pronounced dual specificity. As driving force for this targeted alteration improved membrane oxygenase- and lipoxin A4 synthase-activities were identified. 4. The genomes of extinct human subspecies (H. neanderthalensis, H. denisovan) involve intact genes for all enzymes and receptors of leukotriene signaling. Detailed sequence comparisons and mutagenesis studies suggested their functionality. Conclusions: Although LOXs frequently occur in higher plants and animals, they are not widely distributed in bacteria and have not been detected so far in archaea. These data suggest that there has not been a systematic evolution of LOX isoforms in primitive organisms. In contrast, the enzymes characterized in lower species were most likely introduced by horizontal gene transfer. On the basis of the currently available data it is impossible to precisely date the introduction of LOXs and leukotriene signaling during the evolution of higher organisms. However, leukotriene signaling was already present in zebrafish suggesting a wider distribution of this pathway in bony fish.