Untersuchung zur physiologischen Rolle von PRG-1 anhand der Generierung und Phänotypisierung von PRG 1 defizienten Mausmodellen

Abstract

Die Informationsübertragung an Synapsen ist essentiell für neuronale Prozesse im Nervensystem. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das gehirnspezifische, neuronale Protein Plasticity-Related-Gene-1 (PRG-1) die exzitatorische Informationsübertragung an Synapsen moduliert. PRG-1 ist ein integrales Membranprotein und zeigt deutliche Homologien zu Lipid Phosphat Phosphatasen (LPP). So besitzt PRG-1 die charakteristischen LPP Merkmale von drei konservierten Domänen, welche es den LPPs erlauben, „bioaktive“ Lipidphosphate wie Phosphatidat (PA), Lysophosphatidat (LPA) oder Sphingosin-1-Phosphat (S1P) enzymatisch zu dephosphorylieren. Solche Lipidphosphate sind Schlüsselfaktoren in Rezeptor vermittelten Signalkaskaden (z.B. über LPA-Rezeptoren) und sind daher an einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt. Deshalb wird angenommen, dass LPPs mittels dieses Phosphatase Motivs als negative Regulatoren solcher rezeptorvermittelten Signaltransduktionen fungieren. Im Gegensatz zu den LPPs besitzt jedoch PRG-1 ein unvollständiges Phosphatase Motiv, so dass es nicht diesen Mechanismus der Dephosphorylierung durchführen kann. Trotzdem konnte in früheren Arbeiten in einer neuronalen Zelllinie, die mit einem PRG-1-GFP Fusionskonstrukt transfiziert wurde und LPA ausgesetzt wurde, eine erhöhte Konzentration an LPA Degradationsprodukten sowie Schutz vor LPA-induzierter Neuritenretraktion beobachtet werden. Um die physiologische Rolle von PRG-1 und dessen Einfluss auf Lipidphosphat- vermittelte Signaltransduktion genauer zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine konstitutive und eine konditionelle Knockout (KO) Maus für PRG-1 generiert. Unter Verwendung einer eingefügten Reporterkassette innerhalb des konstitutiven KO Deletionskonstruktes konnte im Hippocampus eine spezifische Expression von PRG-1 in glutamatergen, Neuronen gezeigt werden. Bei heterozygoten Verpaarungen wurde schließlich beobachtet, dass ca. 50 % der PRG-1 defizienten Nachkommen an den Folgen konvulsiver Anfälle innerhalb der ersten 3 bis 4 Wochen starben. Durch eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dietmar Schmitz konnten diese juvenilen Anfälle durch in-vivo EEG Aufnahmen dargestellt werden. Weiterhin zeigten Kainat Applikationen an adulten heterozygoten und homozogoten PRG-1-KO Tieren eine erhöhte Anfallsbereitschaft dieser Tiere. Elektrophysiologische Messungen in Kooperation mit der AG Schmitz zeigten eine spezifische erhöhte Erregbarkeit der exzitatorisch glutamatergen, hippocampalen CA1 Neurone. Trotz dieser Veränderungen waren die zelluläre Morphologie in Bezug auf die Entwicklung der Neurone bzw. Interneurone, die Expression der wichtigsten synaptischen Marker und die elektrophysiologischen intrinsischer Eigenschaften der Zellen unverändert. Durch die Klonierung von Expressionsvektoren für PRG-1 bzw. Cre- Rekombinase konnte mittels in utero Elektroporationstechniken PRG-1 spezifisch in einzelnen hippocampalen CA1 Neuronen von PRG-1 defizienten Tiere exprimiert bzw. in den generierten, konditionellen PRG-1-cKO Mäusen deletiert werden. Die elektrophysiologische Analyse der elektroporierten und nicht-elektroporierten Zellen zeigte, dass rein postsynaptisches PRG-1 die Präsynapse retrograd beeinflussen muss. Um diesen Einfluss von PRG-1 im Hinblick auf die LPA Signaltransduktionsvorgänge zu untersuchen, wurden Aufnahmeexperimente mit fluoreszenzmarkierten PA Analoga an primären Neuronen von Wildtyp und PRG-1-KO Mäusen durchgeführt. Es zeigte sich, das KO Neurone eine geringere Fähigkeit besitzen, diese Lipidphosphate intrazellulär zu akkumulieren, so dass angenommen wird, dass PRG-1 die extrazelluläre Konzentration an Lipidphosphaten im synaptischen Spalt regulieren könnte. Schließlich zeigte 1. die in utero Elektroporation (IUE) eines PRG-1 Konstruktes, welches an einer essentiellen Aminosäure innerhalb des Phosphatase Motivs mutiert wurde, und 2. die Verpaarung mit einer LPA2 Rezeptor KO Maus, dass die physiologische Funktion von PRG-1 durch dessen Einfluss auf eine Lipidphosphat vermittelte Signaltransduktion an der Synapse definiert sein müsste. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass der LPA2 Rezeptor präsynaptisch, und PRG-1 postsynaptisch spezifisch auf exzitatorischen Synapsen glutamaterger Neurone lokalisiert wurde, beschreibt diese Arbeit einen neuen möglichen Regulationsmechanismus der exzitatorischen Signalübertragung, der über PRG-1 vermittelten wird.

Synaptic transmission is the essential feature of neuronal information processing in the nervous system. This thesis reveals that the brain-specific, neuronal protein Plasticity-Related-Gene-1 (PRG-1) modulates synaptic transmission specifically at excitatory synapses. PRG-1 is an integral membrane protein and shows homologies to lipid phosphate phosphatases (LPP). PRG-1 contains the characteristic LPP features of three conserved extracellular domains which enables the LPPs to dephosphorylate bioactive lipid phosphates like phosphatidate (PA), lysophosphatidate (LPA) or sphingosine-1-phosphate (S1P). These bioactive lipid phosphates are key factors in initiating receptor-directed signalling cascades (e.g. via LPA receptors) and are therefore involved in diverse cellular processes. Therefore it has been proposed that LPPs may act as negative regulators of these signalling. In contrast to the LPPs PRG 1 lacks critical amino acids within the conserverd domains which imply that PRG-1 is not able to dephosphorylate LPA using the same mechanism which has been proposed for the LPPs. However, in earlier studies it has been shown, that the neuronal cell line N1E-115, transfected with a PRG-1-GFP fusion construct and exposed to LPA, exhibits increased extracellular LPA dephosphorylation products and thereby protection against LPA induced neurite collapse. In order to elucidate the physiological role of PRG-1 and its influence in lipid phosphate mediated signal transduction a constitutive and a conditional PRG-1 knockout (KO) mouse were generated. Thereby a specific expression of PRG-1 has been shown in glutamatergic neurons of the hippocampus by using an introduced reporter construct within the constitutive deletion construct. Furthermore it was observed that during heterozygous breeding approximately 50 % of PRG-1 deficient litters died due to the consequences of spontaneous seizures within the first three postnatal weeks. By cooperation with the group of Prof. Dietmar Schmitz these juvenile seizures could be monitored by in-vivo EEG recordings. Furthermore kainat applications demonstrated in adult heterozygous and homozygous PRG-1 KO animals a reduced threshold to develop seizures. Electrophysiological measurement in cooperation with the group of Prof. Dietmar Schmitz revealed a specific increase of excitability of hippocampal glutamatergic CA1 neurons. Despite these results, the cellular morphology regarding the development of neurons and interneurons, the expression of important synaptic markers and the electrophysiological intrinsic properties of the cells were unchanged. By generating expression vectors for PRG-1 and Cre-recombinase and utilizing in-utero electroporation techniques PRG-1 could be expressed specifically in single CA1 neurons of PRG-1 deficient animals respectively could be deleted in the generated conditional PRG-1-cKO mice. The electrophysiological analysis of electroporated and non-electroporated cells revealed that postsynaptic PRG 1 influences the presynapse. To further elucidate the impact of PRG-1 regarding LPA signal transduction uptake experiments with fluorescent labelled PA analogs has been performed on WT and PRG-1-KO primary neurons. Thereby it was revealed that KO neurons possess a reduced capability to accumulate lipid phosphates within the cell which led to the hypothesis that PRG-1 can regulate the extracellular concentration of lipid phosphate within the synaptic cleft. Finally, by in-utero electroporation of a PRG-1 expression construct which has been mutated at an essential amino acid within the conserved domain and by breeding of the PRG-1-KO mice with the LPA2 receptor KO mice it has been shown, that the physiological function of PRG-1 may be defined by its influence in lipid phosphate mediated signal transduction at the synapse. Under consideration of the fact that the LPA2 receptor is localised presynaptically and PRG-1 is localised postsynaptically at excitatory synapses of glutamatergic neurons this thesis describes a new possible mechanism of regulating excitatory transmission mediated by PRG-1.