Der Hedgehog Signalweg und dessen Regulation durch microRNAs in der postnatalen Darmentwicklung des Schweins

Abstract

Die Liganden des Hedgehog Signalwegs sind als Morphogene in der embryonalen und postnatalen Darmentwicklung bekannt und regulieren im adulten Intestinaltrakt die Aufrechterhaltung der Homöostase im Gewebe. Sie werden vom mukosalen Epithel exprimiert und gelangen in parakriner Weise zu ihren Zielzellen im Mesenchym. Dort haben sie eine anti-proliferative und differenzierungsfördernde Wirkung. Die miRNA-Familie miR- 15a/15b/16/195/424/497 wurde in diesem Kontext als möglicher Regulator des Signalproteins Indian Hedgehog (IHH) identifiziert. Zu Beginn der Arbeit sollten Methoden für die exakte Identifizierung der beteiligten regulatorischen RNA-Sequenzen und der miRNA-mRNA Interaktionen entwickelt werden. Zu diesem Zweck wurde ein Stem Loop 3' UTR RACE PCR Protokoll (SLURP) sowie ein Protokoll zur Amplifikation, Mutagenese und Assemblierung von miRNA- Zielsequenzen in 3' UTR (SMAP) etabliert. Diese Methoden ermöglichten die schnelle Amplifikation und Sequenzierung relevanter 3' UTR, sowie die Herstellung von Reporterplasmiden zur in vitro Verifikation der miRNA-mRNA Interaktion. Die Reportergen-Assays zeigten eine deutliche Herabregulation von IHH durch Mitglieder der miR-15 Familie (miR-15b, miR-195, miR-424 und miR-497). Auch in mRNA-Degradationsassays konnte dieser Effekt beobachtet werden. Im Anschluss an den Nachweis der Interaktion von miR-15 Familie und IHH in vitro wurden in vivo Proben von 7-56 Tage alten Ferkeln auf die Expression und Regulation von 11 wichtigen Faktoren des Hedgehog Signalwegs durch RT-qPCR-Arrays untersucht. In Ileum und Kolon zeigte sich im Entwicklungsverlauf der Tiere eine Reduktion der Expression beinahe aller Hedgehog Faktoren zwischen den Tagen 7 und 56. Vor allem in der Absetzphase der Tiere (Tag 28-31), besonders im Kolon, war dieser Effekt deutlich zu erkennen. Die Absetzphase bedeutet für den porzinen Intestinaltrakt eine sehr abrupte Umstellung von der Muttermilch auf eine neue Ernährung sowie die Konfrontation des mukosalen Epithels mit einer neuen Zusammensetzung der Mikrobiota und neuen Pathogenen. Die hierdurch erforderlichen morphologischen Anpassungen involvieren somit auch Signalkaskaden wie den Hedgehog Signalweg. Die Analyse der Expression der miR-15 Familienmitglieder im Kolon zeigte für die miRNA miR-15a/b und miR-195 eine im Vergleich zu IHH antikorrelierte Expression mit einem deutlichen Anstieg von Tag 7-28 sowie von Tag 31-56. Auch für diese miRNA war ein Effekt durch die Absetzphase der Ferkel zu verzeichnen. Zusammengefasst deuteten somit auch die in vivo Expressionsdaten auf eine Regulation von IHH durch Mitglieder der miR-15 Familie hin. Die erstmalige Lokalisation ausgewählter miRNA-Familienmitglieder durch in situ Hybridisierungen im Kolon fand bei 14, 31 und 56 Tage alten Tieren statt. Dabei zeigten sich unterschiedliche Expressionsmuster der miRNA im porzinen Gewebe. Die immunhistochemische Detektion von IHH konnte ebenfalls gewebsspezifische Abhängigkeiten aufdecken. Da eine Kolokalisation der ausgewählten miR-15 Familienmitglieder mit IHH nicht klar festgestellt werden konnte, müssen fortführende Experimente durchgeführt werden. Der porzine Darm stellt ein wichtiges Modelsystem zur Erforschung der postnatalen Darmentwicklung von Säugetieren dar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Methoden und Ergebnisse geben Einblick in die komplexe Verknüpfung der Hedgehog Signalkaskade sowie der miR-15 Familie in diesem multifaktoriellen Prozess.

The ligands of the hedgehog signaling pathway are known as morphogens in the embryonic and postnatal development of the intestine. In the adult intestinal tract they are responsible for maintaining the homeostasis in the tissue. They are expressed by the mucosal epithelium and arrive in a paracrine manner to their target cells in the mesenchyme with an anti-proliferative and differentiation-promoting effect. The miRNA family miR-15a/15b/16/195/424/497 was identified as a possible regulator of the signaling protein Indian Hedgehog (IHH). The first aim of the study was to develop methods for the efficient and accurate identification of the involved regulatory RNA sequences and the miRNA-mRNA interactions. For this purpose, a Stem Loop 3' UTR RACE PCR protocol (SLURP), and a protocol for the amplification, mutagenesis and assembly of miRNA targetsites in 3' UTR (SMAP) was established. These methods allowed the rapid amplification and sequencing of relevant 3' UTR and the production of reporterplasmids for the in vitro verification of the interaction between miRNA and mRNA. Luciferase reporter gene assays showed a significant downregulation of IHH by selected members of the miR-15 family (miR-15b, miR-195, miR-424 and miR-497). This effect was observed in mRNA Degradationsassays as well. Following the confirmation of the interaction between IHH and the miR-15 family in vitro, we examined in vivo samples of 7-56 day old piglets on the expression and regulation of 11 important Hedgehog signaling factors by using RT-qPCR arrays. In the ileum and colon, we found a reduction in the expression of almost all Hedgehog factors between days 7 and 56. Especially in the period of weaning (days 28-31), particularly in the colon, this effect was clearly visible. During weaning a very abrupt transition from breast milk to a new diet takes place, as well as the confrontation of the mucosal epithelium with a new microbiota and pathogens in the porcine intestinal tract. The necessary morphological adaptations also involve signaling cascades such as the Hedgehog pathway . The expression analysis of the miR-15 family members in the colon showed for the miRNA miR- 15a/b and miR-195, compared to IHH, an anti-correlated expression with a significant increase from day 7-28 and from day 31-56. A weaning effect was also visible for these miRNA. In summary, the in vivo expression data indicate a regulation of IHH by members of the miR-15 family. The first-time localization of selected miRNA family members with in situ hybridizations in the colon was done in 14, 31 and 56 days old animals. The miRNA showed different expression patterns in the porcine tissues. The immunohistochemical detection of IHH could also reveal tissue-specific dependencies. So IHH was detected on epithelia, in mucosal mesenchyme and within the smooth muscle tissue. As a co-localization of the selected miR -15 family members with IHH could not be clearly discovered, additional experiments are required. The porcine intestine is an important model for the study of postnatal development of the mammalian intestine. The results and methods presented in this study give insights into the complex linkage of the Hedgehog signaling pathway and the miR-15 family in this multifactorial process.