Zur Wirksamkeit einer neuen Köderformulierung für die orale Immunisierung des Schwarzwildes gegen Klassische Schweinepest: Vergleichende experimentelle Studien zur Vakzination mit C-Vakzine und chimären Pestiviren

Abstract

Die vorliegende Promotionsschrift beschäftigt sich mit der Verbesserung der oralen Immunisierung (o.I.) des Schwarzwildes gegen Klassische Schweinepest (KSP), wobei die Hauptzielsetzung in der Entwicklung einer neuen Köderformulierung bestand. Grundsätzliches Ziel der o.I. ist die Erhöhung der Herdenimmunität und das Zurückdrängen des Erregers aus der Schwarzwildpopulation in möglichst kurzer Zeit. Durch das Erreichen einer höheren Köderaufnahmerate bei den Frischlingen wäre es möglich, die Seroprävalenzrate innerhalb der Population deutlich zu erhöhen und im Gegenzug die Anzahl empfänglicher Tiere zu reduzieren, wodurch es möglich wird, die KSP im Wildschweinebestand noch effektiver zu bekämpfen. In den Aufnahmestudien mit Haus- und Wildschweinen konnte gezeigt werden, dass Tiere im Alter von unter 4 Monaten den Köder nur inkomplett aufnehmen. Ab dem Alter von vier Monaten wurde ein aktives Aufnahmeverhalten festgestellt, wobei die Tiere zu dem Zeitpunkt eine Präferenz für runde und möglichst kleine Köder entwickelten, später, im Alter von fünf und sechs Monaten, wurde der 3 cm große kugelförmige Köder sehr gut aufgenommen. Dieser 3 cm große runde Köder bildete die Grundlage für die Erprobung eines neuen Vakzinebehältnisses. Um die erforderliche Virusmenge in Vakzinekapseln und damit letztlich in den Köder zu bekommen, wurde der Impfstoff ( C -Virus/CP7_E2alf) lyophilisiert, in Hartgelatinekapseln abgefüllt und anschließend in die Ködermasse verbracht. Nach den Studien zur Köderaufnahme wurde die Stabilität des lyophilisierten Impfstoffes, verwendet wurden konventionelles C -Virus und das chimäre Pestivirus CP7_E2alf, im Vergleich zur jeweiligen Vakzinevirusformulierung in flüssiger Form bei verschiedensten Umgebungstemperaturen überprüft. Beide getesteten Impfviren zeigten eine signifikant höhere Stabilität im gefriergetrockneten Zustand als in flüssiger Form. Durch die höhere Stabilität (p > 0,05) des Lyophilisates bei Temperaturen über 20°C (Brutschrank- und Raumtemperatur), stellt die neue Formulierung eine Verbesserung dar und eignet sich demnach speziell für Immunisierungskampagnen bei höheren Umgebungstemperaturen (im Sommer und bei Einsatz der o.I. in wärmeren Regionen). In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil der tierexperimentellen Studien die Wirksamkeit der neuen Köderformulierung mit lyophilisiertem C -Virus untersucht. Nach Verfütterung der runden Vakzineköder an Haus- und Wildschweine und anschließender Infektion mit einer geringen KID50-Dosis des KSPV-Stammes Alfort 187 erwiesen sich alle vakzinierten Haus- und Wildschweine als optimal geschützt. Nach Infektion traten zudem weder Virämie noch Virusausscheidung per Nasen-, Augen- und Speichelflüssigkeit sowie Kot auf. In einem zweiten Bestätigungsversuch wurden Schweine mit lyophilisierter C -Vakzine und dem 3 cm großen runden Köder immunisiert, gefolgt von einer Challengeinfektion mit 1.000 KID50/ml. Auch hierbei zeigte sich, dass alle Tiere, die den Köder komplett gefressen hatten, geschützt waren und kein Virus aus Blut und Tupferproben isoliert werden konnte. Die Schweine entwickelten hohe Ak-Titer. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die neue Köderformulierung bestehend aus a) einem kleineren Köder (d = 3 cm) b) einer Hartgelatinekapsel mit Snap-Verschluss und c) lyophilisiertem C -Virus die Schweine vor einer Infektion mit KSPV schützen kann, bei gleichzeitigem Fehlen von Virämie und Virusausscheidung. Auf Grund der Tatsache, dass DIVA-Vakzinen perspektivisch die Bekämpfungsmaßnahmen gegen die KSP bei Haus- aber auch bei Wildschweinen positiv beeinflussen könnten, wurde im Rahmen eines EU-Projektes u.a. an der Entwicklung neuer Markerimpfstoffe gearbeitet. Daher wurden die letzten beiden Tierversuche, die in der vorliegenden Arbeit beschrieben sind, mit dem chimären Markerimpfstoff CP7_E2alf durchgeführt, und zwar auch in lyophilisierter Form mit dem größeren kugelförmigen Köder in Analogie zu den Experimenten mit C -Virus. Im Gegensatz zum C -Stamm gelang es mit der gefriergetrockneten Chimäre CP7_E2alf jedoch nicht, die Schweine vor einer letalen Infektion zu schützen. Es erkrankten alle Haus- und Wildschweine klinisch an KSP. Sie zeigten eine Virämie, schieden das Challengevirus über Nasen-, Augen- und Speichelflüssigkeit sowie den Kot aus und verendeten bzw. mussten getötet werden. Inwieweit dieser negative Ausgang auf einen zu geringen Virusgehalt zurückzuführen oder aber Resultat des nicht optimalen E1E2-Heterodimer- Komplexes in der Chimäre war, konnte zu dem Zeitpunkt nicht abschließend geklärt werden. Daher wurde ein weiterer Tierversuch mit der veränderten CP7_E2alf-Chimäre durchgeführt, die nunmehr neben dem E2-Gen des KSPV Alfort 187 auch dessen E1-Gen anstelle des E1-Gens des BVDV enthielt (CP7_E1E2alf). Neben diesem neu konstruierten Virus kamen die bisherige Chimäre CP7_E2alf und das C -Virus parenteral zum Einsatz. Im Tierversuch mit Hausschweinen konnte bei beiden chimären Pestiviren wie auch beim C -Virus nach parenteraler Injektion ein kompletter Schutz der Tiere vor einer klinischen Infektion ermittelt werden, verbunden mit dem Fehlen einer Virusübertragung respektive -ausscheidung. Die Läuferschweine bildeten pv neutralisierende Ak aus, wobei zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion die Tiere der CP7_E1E2-Gruppe im VNT die höchsten neutralisierenden Ak-Titer aufwiesen, gefolgt von den mit C -Virus und der Chimäre CP7_E2alf vakzinierten Tieren. Auf Grund der höheren Ak-Titer bei den Schweinen der CP7_E1E2alf-Gruppe kann angenommen werden, dass sich dieses Konstrukt mit dem KSPV-E1E2-Heterodimer als optimaler bzgl. der Ausbildung neutralisierender Ak erweist. Untersuchungen zur oralen Wirksamkeit sowie zur Stabilität und Sicherheit dieser neuen Chimäre sind nicht Teil dieser Arbeit, stellen aber weitere wichtige Forschungs-aufgaben dar. Mit Hilfe der neu konstruierten Köderformulierung sollte es möglich werden, einen höheren Anteil an Frischlingen via o.I. zu erreichen, wodurch mehr Tiere vor einer KSP-Infektion geschützt werden, sich somit nicht mehr infizieren können und damit auch nicht zum Virusträger werden und den Erreger verbreiten. Durch die bessere Stabilität der lyophilisierten Vakzine im Vergleich zur flüssigen Formulierung sollte auch bei hohen Umgebungstemperaturen und längerer Liegezeit der Köder die MID nicht unterschritten werden und somit eine effektive Immunisierung der Wildschweine über einen langen Zeitraum gegeben sein. Sollte sich in weiteren wissenschaftlichen Untersuchungen die lyophilisierte CP7_E1E2alf-Chimäre als oral wirksam erweisen, wäre diese Chimäre ein klassischer DIVA-Vakzinekandidat, der die geforderte Unterscheidung von geimpften und infizierten Tieren auch beim Wildschwein möglich machen würde.

This thesis deals with the advancement of oral immunization of wild boar, focussing on the creation of a new bait formulation. The basic objective of oral immunization is to enhance herd immunity and to eliminate the CSF pathogen within a short time frame. Higher bait uptake rates in gruntlings would on one hand lead to an increase of the seroprevalence rate in the wild boar population and on the other hand to a reduction of the number of susceptible animals. This would permit an even more effective control of CSF in the wild boar population. The uptake studies performed with domestic pigs and wild boar described in this exposition revealed, that gruntlings below four months of age only played with the baits and showed an incomplete uptake. By four months of age, the animals began to develop an active bait uptake initially showing a preference for the small baits (1.8 cm diameter). By the age of five to six months, the animals began to pick up the spheroidal 3 cm bait. The 3 cm bait was taken as a model for the creation of a new box vaccine container. In order to incorporate a sufficient amount of virus antigen into the bait, the vaccine ( C -strain/CP7_E2alf) was lyophilised and filled into hard gelatine capsules which were then covered with the maize bait masse. Following investigations on the bait uptake, the lyophilised vaccine (we used the conventional C -strain and the chimeric pestivirus CP7_E2alf) was examined for its stability in comparison to the liquid formulation under different environmental conditions. It could be shown, that both vaccines are much more stable in the lyophilised than in the liquid form (p < 0,05). Due to the higher stability of lyophilised vaccine at temperatures over 20°C, the new formulation represents an improvement and is especially suitable for immunization campaigns carried out at higher environmental temperatures (in summer or in warmer regions). In the first part of the animal experiments carried out for the present thesis, the efficacy of the bait formulation containing lyophilised C -strain virus was studied. After administration of the spheroidal vaccine baits to wild boar and domestic pigs followed by an infection with a low dose of CSFV strain Alfort 187 , all vaccinated domestic pigs and wild boar were protected from a CSF infection and we were neither able to isolate challenge virus from BC nor from nasal mucous, eye fluid, saliva or faeces. In a second confirmatory trial, pigs were immunised with lyophilised C -strain and the spheroidal 3 cm bait and were subsequently subjected to a challenge infection with 1,000 TCID50/ml. Again, the animals, which had picked up the bait completely, were protected from a lethal CSFV infection. Neither viremia nor virus shedding could be detected. The pigs developed high neutralising antibody titres. To conclude, the new bait- formulation consisting of: a) a smaller bait (d = 3 cm) b) a hard gelatine capsule with snap-lock and c) lyophilised C -virus is able to protect pigs against a severe CSF infection and simultaneously prevent viremia and virus transmission. As in the future DIVA vaccines might have a positive impact on the control strategies against CSF in domestic pigs and wild boar, the development of new marker vaccine candidates also was one of the aims of an EU-project. Therefore, the last two animal experiments described in this thesis were performed in line with this project, using the chimeric marker vaccine CP7_E2alf in a lyophilised formulation with the bigger spheroidal bait and analogously to the experiments carried out with C -virus. In contrast to the C -strain, the freeze-dried chimera was not able to protect the infected pigs from a lethal infection. All vaccinees (wild boar and domestic pigs) became ill showing CSF typical symptoms. In the virological examination, virus was found in the blood as well as in all body fluids examined (nasal mucous, eye fluid, saliva and faeces), so that the animals died or had to be killed in a moribund state. We could not clarify conclusively whether the negative result of this animal experiment was due to low virus antigen content or rather the consequence of a non-optimal E1E2-heterodimer-complex in the chimera. Based on these findings, another animal trial was performed with an improved CP7_E2alf chimera consisting of the E2-gene of CSF-strain Alfort 187 and the E1-gene of this CSFV strain instead of the E1-gene of BVDV (CP7_E1E2alf). Besides this newly created virus the previous chimera CP7_E2alf and the C -virus were used for parenteral vaccination. In animal experiments with domestic pigs, a complete protection from clinical signs and virus excretion could be observed with both chimeric pestiviruses and in the C -virus group after i.m. immunization. After vaccination, the weaner pigs developed neutralising antibodies, whereas at the time point of challenge the animals of the CP7_E1E2alf group reached the highest antibody titres in the virus neutralisation test, followed by the C -virus vaccinated and the CP7_E2alf immunised pigs. Because of the higher antibody titres in the CP7_E1E2alf group, it could be assumed that this construct with its CSF- E1E2-dimer is more effective with regard to the production of neutralising antibodies. Further studies on the efficacy of this new chimera after oral administration as well as on its stability and safety are not part of this thesis, but are regarded as important exploratory focuses for future research. With the new bait formulation it should be possible to reach a larger number of gruntlings by oral immunization. As a result, more animals will be protected against CSFV infection and in the consequence will not be able to serve as virus carriers spreading and shedding the CSF pathogen. Due to the improved stability of the lyophilised vaccine in comparison to the liquid suspension, the virus antigen content should not fall below the MID, even at high environmental temperatures and if the baits are not taken up for several days after distribution. This should lead to an effective immunization of wild boar over a long time period. If further scientific studies prove that the lyophilised CP7_E1E2alf chimera is efficient after oral administration, this vaccine can be considered as a classical DIVA vaccine candidate which allows to discriminate field-virus infected animals from vaccinated animals also in wild boar.