dc.contributor.author
Göhler, Heike
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:08:50Z
dc.date.available
2006-01-25T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/626
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4828
dc.description
Titel, Danksagung, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Identifizierung eines Protein-Interaktionsnetzwerks für Huntingtin 21
2.1 Ergebnisse 21
2.2 Diskussion 59
3 Polyglutaminabhängige Induktion von Hefeprionen 73
3.1 Ergebnisse 73
3.2 Diskussion 108
4 Materialien und Methoden 118
4.1 Materialien 118
4.2 Methoden 133
5 Zusammenfassung 170
6 Abstract 172
7 Literaturverzeichnis 174
8 Abkürzungsverzeichnis 195
9 Publikationen 197
10 Lebenslauf 198
11 Anhang 199
dc.description.abstract
Chorea Huntington (HD) ist eine vererbbare, progressiv verlaufende
neurodegenerative Erkrankung, die durch eine verlängerte Polyglutaminsequenz
in dem Protein Huntingtin (Htt) verursacht wird. Aufgrund dieser Veränderung
aggregiert mutiertes Htt und lagert sich in Form von neuronalen
Einschlusskörpern im Gehirn von HD-Patienten ab. Bis heute ist weder die
zelluläre Funktion von Htt, noch der Pathomechanismus von HD vollständig
aufgeklärt. Da Htt mit Proteinen interagiert, die bekanntermaßen eine Rolle
bei der Transkriptionsregulation, bei der Endozytose sowie bei der
Signalübertragung spielen, ist wahrscheinlich, dass auch Htt an diesen
Prozessen beteiligt ist. Um die Funktion von Htt weiter aufzuklären, wurde in
dieser Arbeit ein Protein-Interaktionsnetzwerk für Htt mit Hilfe von Hefe Two-
Hybrid cDNA-Bank- und Array-Screens erstellt. Das Htt-Netzwerk setzt sich aus
64 Proteinen, die 186 Interaktionen ausbilden, zusammen. 165 dieser
Interaktionen waren bisher nicht in der Literatur beschrieben. Um die Qualität
des Datensatzes zu belegen, wurden 54 Protein-Interaktionen anhand von in
vitro Bindungsexperimenten überprüft und in 35 Fällen (65 %) bestätigt. Durch
Y2H-Screens wurden insgesamt 19 direkte Interaktionspartner von Htt
identifiziert, von denen die meisten in transkriptionale Prozesse involviert
sind. Das Htt-Netzwerk gibt neue Einblicke in die Funktion von Htt und kann
als Ausgangspunkt für die Untersuchung von Proteinen genutzt werden, die
möglicherweise mit der Pathogenese von HD assoziiert sind. Ein neu
identifizierter Interaktionspartner von Htt ist GIT1, ein mit einer G-Protein
gekoppelten Rezeptor-Kinase interagierendes Protein. In vitro durchgeführte
Aggregationsexperimente zeigten, dass GIT1 die Aggregation von mutiertem Htt
fördert. C-terminale GIT1-Fragmente rekrutierten mutiertes Htt in
vesikelartige perinukleare Strukturen, wodurch möglicherweise die Htt-
Aggregation beschleunigt wird. In Gehirnen von verstorbenen HD-Patienten wurde
GIT1 in den von Htt gebildeten neuronalen Einschlusskörpern nachgewiesen.
Interessanterweise konnte in geschädigten Gehirngeweben von HD-Patienten kaum
vollständiges GIT1 detektiert werden. Stattdessen traten dort überwiegend
C-terminale GIT1-Fragmente auf. Dies deutet darauf hin, dass GIT1 bei HD
proteolytisch prozessiert wird. Eine veränderte zelluläre Verteilung und eine
Beeinträchtigung der Funktion von GIT1 tragen möglicherweise zur Pathogenese
von HD bei. Zur Familie der neurodegenerativen Krankheiten gehören neben HD
auch die Prionenerkrankungen. Diese werden durch ein einziges falsch
gefaltetes Protein, dem sogenannten Prionenprotein PrP, hervorgerufen. Der
Mechanismus, der zur Falschfaltung von PrP führt, ist bis heute nicht
vollständig aufgeklärt. In dieser Arbeit wurde die spontane Entstehung von
Prionen in S. cerevisiae untersucht, da diese Hefe ein einfaches und gut
etabliertes Modellsystem für die Charakterisierung von Prionen darstellt. Das
Hefeprion [PSI +] entsteht durch Falschfaltung und der daraus resultierenden
Aggregation des an der Translation beteiligten Terminationsfaktors Sup35. Ein
besonderes Merkmal von [PSI +] ist, dass seine spontane Entstehung die Präsenz
anderer Prionen wie z.B. [PIN +] voraussetzt. In dieser Arbeit wurde gezeigt,
dass [PSI +] auch unabhängig von präexistierenden Prionen induziert werden
kann, wenn Sup35 mit Htt-Exon1 Fragmenten mit 54 oder 92 Glutaminen fusioniert
ist. Die entsprechenden Fusionsproteine bildeten bei Expression in Hefe
Aggregate und stimulierten die Aggregation von endogenem Sup35. Auch bei
Expression von PrD-Htt Fusionsproteinen, die aus der N-terminale Domäne von
Sup35 und Htt-Exon1 Fragmenten mit 54 oder 92 Glutaminen bestehen, wurde der
[PSI +]-Phänotyp induziert. Die Effizienz der de novo Induktion von [PSI +]
war sowohl von der Polyglutaminlänge als auch von der
Aggregationsgeschwindigkeit der Fusionsproteine abhängig. Die Beobachtung,
dass der durch Expression von Sup-Htt entstandene [PSI +] Phänotyp, auch nach
Verlust der für die Fusionsproteine kodierenden Plasmide stabil von der
Mutter- auf die Tochterzelle vererbt wird, weist darauf hin, dass Sup-Htt
Aggregate nur für die de novo Entstehung nicht aber für die Vererbung von [PSI
+] erforderlich sind. In Übereinstimmung mit den in vivo Daten zeigten in
vitro Versuche mit aufgereinigten Proteinen, dass PrD-Htt Fusionsproteine
spontan amyloidartige Fibrillen bilden und dass diese Aggregate die
Polymerisation von aufgereinigtem löslichen Sup35-Protein initiieren können.
Die polyglutaminabhängige de novo Induktion des Hefeprions [PIN +] zeigt, dass
sich durch die Fusion mit aggregationsfördernden Polyglutaminsequenzen auch
andere Prionen erzeugen lassen. Somit weisen die hier präsentierten Ergebnisse
darauf hin, dass die spontane Aggregation des löslichen Prionenäquivalents die
molekulare Basis für die Entstehung von Hefeprionen ist.
de
dc.description.abstract
Huntington´s Disease (HD) is an inherited, progressive neurodegenerative
disorder caused by an elongated polyglutamine stretch in the protein
huntingtin (htt). The prolonged polyglutamine sequence triggers aggregation of
mutant htt and causes the formation of neuronal inclusions in HD patient
brains. Neither the cellular function of htt nor the pathomechanism of HD are
currently known. Because of its interactions with a variety of characterized
proteins, htt is believed to be involved in different cellular processes
including transcription, endocytosis and cell signaling. To further
investigate the function of htt, this study placed htt in a comprehensive
network of protein interactions. The network was generated from data obtained
by yeast two-hybrid (Y2H) cDNA-library and array screens. The htt network
includes 186 physical interactions among 64 proteins. 165 of these
interactions have not been described before. To evaluate the quality of the
Y2H data, 54 interactions were tested by in vitro binding experiments and 35
interactions (65 %) were confirmed. In total 19 direct interaction partners of
htt were identified by Y2H screens, most of which were associated with
transcriptional regulation. The HD network provides additional clues to htt
function and moreover is a valuable starting point to identify proteins
involved in HD pathogenesis. An important novel interaction partner of htt
identified in this study is GIT1, a G protein-coupled receptor kinase-
interacting protein. In vitro aggregation experiments have shown that GIT1 is
crucial for htt aggregation. Moreover, C-terminal GIT1 fragments recruit
mutant htt into vesicle-like perinuclear structures which probably is the
mechanism underlying GIT1-mediated enhancement of htt aggregation.
Immunohistochemical studies revealed that GIT1 is present in neuronal
inclusions that typically appear in the brain of HD patients. Furthermore, a
reduced amount of full-length GIT1 was observed in the brains of diseased
patients while significant amounts of C-terminal GIT1 fragments were found to
be accumulated. These findings suggest that during progression of HD GIT1 is
processed. An abnormal cellular distribution and function of GIT1 may
contribute to HD pathogenesis. Like HD, also the prion diseases belong to the
family of neurodegenerative disorders. Prion diseases result from the
misfolding of a single protein, the prion protein PrP. The mechanisms leading
to misfolding of PrP and to toxicity are unclear. In this study the
spontaneous appearance of prions in the yeast S. cerevisiae was investigated.
Yeast is as a simple and well-established model system for studying the
properties of prions. The yeast prion [PSI +] results from misfolding and
aggregation of the translation termination factor Sup35. The spontaneous
appearance of [PSI +] requires the presence of other prions such as [PIN +].
This study shows that [PSI +] can form spontaneously in the absence of pre-
existing prions, when the intrinsic propensity of Sup35 to form aggregates is
enhanced by the addition of aggregation-prone htt exon1 fragments containing
54 or 92 glutamines. Expression of the Sup-htt fusion proteins led to the
accumulation of aggregates and stimulated the conversion of endogenous Sup35
from the soluble into the insoluble state. Likewise expression of PrD-Htt
fusion proteins consisting of N-terminal Sup35 and htt exon1 fragments formed
aggregates and induced [PSI +]. The efficiency of the de novo appearance of
[PSI +] was dependent on the length of the polyglutamine expansion and the
aggregation rate of the fusion proteins. Once acquired, the [PSI +] state was
stably transmitted from mother to daughter cells even upon loss of the Sup-htt
fusion proteins, indicating that Sup-htt aggregates are required for induction
but not for propagation of [PSI +]. In line with the in vivo data, in vitro
studies revealed that purified PrD-htt fusion proteins spontaneously assemble
into amyloid-like fibers which in turn initiate the polymerisation of purified
soluble Sup35. The polyglutamine-dependent induction of the prion [PIN +] in
the absence of pre-existing prions supports the hypothesis that also other
prions can be induced by the addition of polyglutamine tracts. Thus, the
presented data suggest that spontaneous aggregation of the nonprion protein is
the molecular basis for the de novo appearance of yeast prions.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
protein interaction
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Identifizierung eines Protein-Interaktionsnetzwerks für Huntingtin und
polyglutaminabhängige Induktion von Hefeprionen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Erich Wanker
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gerd Multhaup
dc.date.accepted
2006-01-24
dc.date.embargoEnd
2006-01-26
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2006000314
dc.title.translated
Identification of a Protein-Interaction Network for Huntingtin and
Polyglutamine-mediated Induction of Yeast Prions
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001955
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/31/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001955
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dcterms.accessRights.openaire
open access