Untersuchung der Regulation und der prognostischen Bedeutung des mTOR- Signalweges in Ovarialkarzinomen

Abstract

Das Ovarialkarzinom steht an achter Stelle der weiblichen Krebserkrankungen und ist von allen gynäkologischen Tumoren derjenige mit der höchsten Mortalitätsrate. Die Therapie des Ovarialkarzinoms basiert auf der operativen Resektion und der Chemotherapie, wobei bisher bei nur 15-20% der Patientinnen eine Langzeitremission nach Chemotherapie erreicht wird. Daher werden im Rahmen aktueller Forschungsprojekte die veränderten molekularen Mechanismen im Tumorgewebe untersucht, um aus diesem Verständnis neue und molekular definierte individualisierte Therapien abzuleiten. Rapamycin und seine Analoga sind dabei viel versprechende potentielle neue molekulare Tumortherapeutika. Rapamycin bindet das Enzym mTOR, wodurch die Kaskade zur Translationseinleitung unterbrochen wird. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in Ovarialkarzinomzelllinien den Einfluß von Rapamycin auf die Zellproliferation und den mTOR-Signalweg zu untersuchen. Parallel wurde die Phospho-mTOR Expression im Tumorgewebe untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurden Zellkulturversuche an drei Ovarialkarzinomzelllinien durchgeführt. Eine signifikante Inhibition der Zellproliferation war in allen drei Zelllinien nach Inkubation mit Rapamycin im XTT –Test nachweisbar. In OVCAR-3 bis zu 63% (p<0,0041 nach 72-stündiger Behandlung, p<0,019 nach sechstägiger Behandlung), in SK-OV-3 bis zu 48% (p<0,02, sowohl nach 72-stündiger als auch nach sechtägiger Behandlung) und in A 27/80 bis zu 53% (p<0,006 nach 72-stündiger Behandlung, bzw. p<0,022 nach sechstägiger Behandlung). Durch FACS-Analysen konnte bei allen drei Zelllinien ein Zellzyklusstillstand in der G1-Phase als Reaktion auf die Rapamycinwirkung beobachtet werden. Dieser Effekt kommt als Ursache für die beschriebene Proliferationshemmung in Betracht. Eine vermehrte Apoptose oder Nekrose war dagegen mittels Durchflusszytometrie in keiner der Zelllinien nachweisbar. Unter Rapamycin-Inkubation wurde die Expression verschiedener Proteine des mTOR-Signalweges im Western-Blot untersucht. Rapamycin führte in allen drei Zellinien zu einer verminderten Expression von Phospho-mTOR. Ebenso zeigte sich die Herunterregulation des nachgeschalteten Proteins 4E-BP1. Unter Wirkung von Rapamycin kam es bei allen drei Zelllinien zu einer erhöhten Phospho-AKT Proteinexpression. Das Protein AKT ist im Signalweg dem mTOR vorgeschaltet und wird unter Rapamycin möglicherweise im Rahmen eines kompensatorischen Mechanismus hochreguliert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression von Phospho-mTOR in einer Kohorte von 83 Ovarialkarzinomen mittels Immunhistochemie untersucht. Die Analyse der Phospho-mTOR-Expression und Korrelation mit klinisch-pathologischen Daten ergab einen Zusammenhang zwischen vermehrter Phospho-mTOR-Expression und einem verbesserten Gesamtüberleben der Patientinnen im Vergleich zu denjenigen ohne eine Phospho-mTOR-Expression (p=0.003, log-rank-Test). Insgesamt sind die Studien ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Tumorentstehung und Progression, um letztlich neue und molekular definierte individualisierte Therapien abzuleiten. Die Ergebnisse dieser Arbeit regen zu weiteren Untersuchungen des mTOR-Signalweges an. Hierbei könnten Untersuchungen mit kombinierter Gabe von Rapamycin und Zytostatika interessante Ansätze für neue therapeutische Konzepte darstellen. Durch das Verstehen der genauen Wirkungsweisen und Folgen von Rapamycin im Signalweg könnten Biomarker gefunden werden, die prädiktiv diejenigen Patientinnen identifizieren, welche von einer spezifischen Therapie profitieren werden.

Ovarian cancer has the highest mortality-rate of all gynaecological tumours. The therapy of ovarian cancer is based on surgery and chemotherapy. A long- term remission is reached for no more than 15-20% of all treated patients. Current research projects investigate alterations of the molecular mechanisms in the tumour tissue in order to develop new molecular and individual therapy strategies. Rapamycin and its analogues are promising and potential agents in anticancer therapy. The cascade of translation initiation is interrupted by the binding of Rapamycin to the enzyme mTOR. The aim of the present study was to investigate the effect of Rapamycin on cell proliferation and the mTOR- pathway in ovarian carcinoma cell lines. The phospho mTOR expression in carcinoma-tissue was analysed. Cell culture experiments on three ovarian carcinoma cell lines represent the first part of this study. A significant inhibition of the cell proliferation after treatment with Rapamycin in all cell lines was observed by XTT-test: in OVCAR-3 up to 63% (p<0,0041 after 72 hours of treatment, p<0,019 after 6 days of treatment), in SK-OV-3 up to 48% (p<0,02 after 72 houres and 6 days of treatment) and in A 27/80 up to 53% (p<0,006 after 72 houres of treatment, p<0,022 after 6 days of treatment). The FACS analysis showed a cell cycle arrest at the G1 phase as a result of Rapamycin treatment. This fact might be the reason for the previously described inhibition of proliferation. Increased apoptosis or necrosis was not recognised by FACS-analysis. The expression of different proteins belonging to the mTOR pathway was examined by western blot after Rapamycin incubation. The result was a reduced expression of phospho mTOR in all three cell lines. The same phenomenon was found for the downstream protein 4E-BP1. An upregulation of phospho AKT was shown in all three cell lines after Rapamycin treatment. The protein AKT is localised upstream of mTOR and its upregulation might be explained by mTOR in a compensatory mechanism. The second part of this study investigated the expression of phospho mTOR in a cohort of 83 ovarian carcinomas using immunohistochemistry. The analysis of the phospho mTOR expression and correlation to clinicopathological data could show a relationship between elevated phospho mTOR expression and a better overall survival in comparison to patients with-out phospho mTOR expression (p=0.003, log-rank-test). Taken together, these studies are a contribution to the understanding of the molecular mechanisms of tumour development and progression, and they might help to create new and molecularly defined and individualised therapy modalities. The findings of the present study are a motivation for further experiments on the mTOR signalling pathway. Treatment with Rapamycin in combination with cytostatics could be an interesting approach for new therapeutic strategies. Understanding the exact function and consequences of Rapamycin application in the mTOR pathway could help to find biological markers for the predictive identification of those patients who will benefit from a specific therapy.