Genetische Analyse im M-Banden-Protein Myomesin bei Patienten mit Hypertropher Kardiomyopathie

Abstract

Die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist eine primäre Herzmuskelerkrankung mit einer Prävalenz von 1:500 (Maron et al., 1994 und Maron et al., 1995). Bei über der Hälfte der Patienten wird eine familiäre Häufung mit meist autosomal dominantem Erbgang mit variabler Expression beobachtet. Der Phänotyp kann von asymptomatisch bis zum plötzlichen Tod (PHT) variieren. Die HCM wird durch linksventrikuläre Hypertrophie ohne sekundäre Ursachen wie Hypertonie, Arteriosklerose oder valvuläre Stenosen diagnostiziert. Sie ist charakterisiert durch eine vergrößerte Wanddicke des linken und/oder rechten Ventrikels 13 mm (McKenna et al., 1997). Die HCM wird meist durch Mutationen in Sarkomer-Proteinen verursacht. Bis heute wurden mehr als 400 Mutationen in 13 Genen als Ursache für die HCM identifiziert (Elliot und McKenna, 2004; Maron et al., 2006). Die meisten der identifizierten Mutationen, die als Ursache für die HCM in Betracht kommen, sind Missense-Mutationen. Der Austausch eines einzigen Nukleotids verursacht einen Aminosäurenaustausch, welcher der Funktionsfähigkeit des Proteins schaden und daher die Entstehung der Krankheit verursachen kann. Ziel dieser Studie war zu beweisen, dass das für die Kodierung des Sarkomerproteins Myomesin zuständige MYOM-Gen bei Fehlfunktion einen Auslöser für die HCM darstellt und sich somit in die lange Liste der HCM-verursachenden Gene einfügt. In dieser Arbeit wurde ein Programm zur Mutationssuche im Genbereich (Exons 7, 8, 9, 22, 23, 24, 25 und 26) des Sarkomerproteins Myomesin etabliert. Als Methoden wurden die Polymerase-Chain- Reaction (PCR), Single-Strand-Conformation-Polymorphism (SSCP)-Analyse und Sequenzierung verwendet. Bei spezielleren Fragestellungen kam zusätzlich noch der Restriktionsenzymverdau zur Anwendung. Es wurden 410 nicht verwandten HCM- Patienten und 307 Kontrollen untersucht. Es wurden vier SNPs (g.47309, g.47317, g.47355 und c.1480 (Codon 382)) und eine Missense-Mutation (c.1502 (Mutation Leu390Phe)) im Bereich des PCR-Produktes des Exons 7 des MYOM-Gens identifiziert. Zwei SNPs (g.56910 und c.1726) sowie eine Missense-Mutation (c.1724 (Codon 464)) wurden im Bereich des PCR-Produktes des Exons 9 identifiziert. Ein weiterer SNP wurde im Bereich der Splice Site des Exons 23 (g.121255 ) entdeckt. Die Identifizierung der Mutation Leu390Phe zeigt, dass Mutationen im MYOM-Gen HCM verursachen können. Die Identifizierung verschiedener SNPs im Splice-Site -Bereich des MYOM-Gens bildet einen Ansatzpunkt für weiterführende Analysen zum Beweis des Einflusses dieser Polymorphismen auf Myomesin und seine Funktion im Sarkomer. Außerdem hat sich gezeigt, dass eine Mutationssuche mit den verwandten Methoden möglich ist. Diese Arbeit stellt einen Beitrag zur Grundlagenforschung der HCM dar. Die zunehmende Identifizierung von HCM-assoziierten Mutationen ermöglicht eine bessere Diagnostik und genetische Beratung der Patienten und somit eine Verbesserung der Behandlungsmöglichkeit der HCM.

Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common inherited cardiac condition and the most important cause of sudden cardiac death (SCD) in the young population (Elliot and McKenna, 2004). The prevalence of hypertrophic cardiomyopathy is about one in 500 adults. (Maron et al., 1994 and Maron et al., 1995). Most adolescents and adults with hypertrophic cardiomyopathy have familial diesease with an autosomal pattern of inheritance. The clinical manifestations of HCM vary from a benign asymptomatic course to that of severe heart failure and SCD (Maron, 1997). HCM is diagnosed clinically by the presence of unexplained left ventricular hypertrophy (absence of hypertension, valvular disease, etc) and a small left ventricular cavity. The hypertrophy is predominantly asymmetric and in the majority of cases affects the interventricular septum. More than 400 mutations were identified in 13 different genes, most of them encode for sarcomeric proteins (Elliot and McKenna, 2004). Genetic data show that mutations in sarcomeric proteins account for only 60% of cases of the disease (Marian and Roberts, 2001; Seidman et al., 2001; Franz et al., 2001 and. Richard et al., 2003), suggesting the existence of more unknown disease genes. We propose in this study a novel diesease gene causing HCM: the myomesin gene (MYOM). The MYOM gene encodes for the protein Myomesin. Myomesin is a protein located on the M-band. The M-Band is a transversal structure in the center of sarcomere that is needed to maintain the regular packing and the precise alignment of thick filaments during sarcomere activation (Agarkova et al., 2003). It has been suggested that the M-band plays an important organizational role during myofibrillogenesis when the nascent thick filaments have to assemble and be aligned into a regular hexagonal lattice (Wang et al., 1998; Ehler et al., 1999; Yang et al., 2000). Methods Eight coding exons of MYOM were amplified using polymerase chain reaction (PCR): exons 7,8,9,22,23,24,25 and 26. Mutation screening was performed by single strand conformation polymorphism analysis (SSCP) under two different conditions with respect to gel composition and running temperature. The DNA banding patterns were visualized by silver staining. Samples with aberrant band patterns were subjected to automated sequencing of both strands. Screening for mutation Leu390Phe in MYOM within family S and controls was done by restricction enzym digestion with Dde I. Clinical evaluation was performed and blood samples were drawn from 410 unrelated patients with HCM and 307 control individuals. Results A total of 410 unrelated HCM patients were examined for genetic variants and mutations in MYOM. We identified a novel missense mutation in exon 7 of MYOM: Leu390Phe, in one unrelated individual out of 410 patients examined. Seven single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified in MYOM. Four of these SNPs were identified in exon 7; one in the coding region and three in the intronic region (c.1480 (Codon 382) and g.47309, g.47317, g.47355). Two SNPs were detected in the coding region of exon 9, one in the coding region (codon 464 (Arg464Arg)) and one in the intronic region (g.56910). A missense mutation was identified in the coding region of exon 9: c.1724 (Codon 464). The other SNP was identified in intron 22 (g121255). The identification of the mutation Leu390Phe in MYOM shows that this kind of mutation may cause HCM. The identification of several SNPs in the splice site of MYOM could be the starting point for further analysis to prove the influence of these SNPs on Myomesin and its function in the sarcomere. Furthermore it has been shown that a search for mutations is possible with related methods. This work is a contribution to the fundamental research of HCM. The increasing identificaion of HCM associated mutations enables better diagnosis and genetical consultation of the patients and hence an improvement of the treatment of HCM.