Prevention of opioid peptide degradation by enzyme inhibitors in a model of painful inflammation

Abstract

Opioids are the strongest analgesics for chronic pain but their action is limited by serious central nervous system (CNS) side effects (e.g. nausea, addition, dependence). In contrast, activation of opioid receptors on peripheral sensory neurons inhibits pain without CNS adverse effects. This can be achieved by exogenously applied opioids and endogenous opioid peptides released from immune cells migrating to inflamed tissue. Nevertheless, opioid peptides are susceptible to enzymatic inactivation. Opioid degradation by peptidases such as aminopeptidase N (APN) and neutral endopeptidase (NEP) was examined in the CNS and leukocytes from healthy animals and humans. We hypothesized that blockade of APN and NEP in inflamed tissue prevents opioid peptide catabolism and locally ameliorates pain. Our major goal was to identify the cellular sources of APN and NEP and their relative catabolic preferences towards opioid peptides Met-enkephalin (MENK), Leu-enkephalin (LENK), dynorphin A (DYN) and endorphin (END) in inflammatory pain. As a model of such condition we employed a complete Freund’s adjuvant-induced unilateral hind paw inflammation in rats. To inactivate peptidases we used bestatin and thiorphan to selectively block APN and NEP, respectively, as well as P8B having equal selectivity for both enzymes. As peptidase sources we investigated immune cells and peripheral nerves. Flow cytometry revealed APN and NEP on macrophages and granulocytes, but not on T lymphocytes from inflamed paws. In vitro, the activity of APN and NEP was determined photospectrometrically as degradation of their specific substrates Ala-βNA and Suc-Ala-Ala-Phe-p-NA, respectively, incubated with leukocyte membranes or suspensions of sciatic nerve peripheral terminals. Accumulation of the respective metabolites βNA and pNA was dose-dependently prevented by bestatin, thiorphan and P8B. Incubation of leukocyte membranes or nerve suspensions with exogenously applied MENK, LENK, DYN and END led to their degradation. In both tissue preparations, the catabolism of MENK and LENK, but not of END, was dose-dependently and fully prevented by a combination of bestatin and thiorphan or by P8B alone. Additionally, the inhibitors prevented degradation of DYN in nerve suspensions. In vivo, concomitant injection of thiorphan and bestatin or of P8B into inflamed paws decreased pain in response to noxious pressure. These antinociceptive effects were completely reversed by antibodies against MENK, LENK and DYN, and were slightly attenuated by anti-END. In conclusion, ENKs are preferred targets of leukocytic and neuronal APN and NEP in inflamed tissue. DYN emerges as an additional substrate of both enzymes on peripheral nerves. Selective blockade of ANP and NEP hindered the degradation of ENKs and DYN, and ameliorated inflammatory pain. Thus, preventing opioid peptide degradation in injured tissue represents attractive free from CNS side effects physiological approach to conquer pain in its origin.

Opioide sind die stärksten Analgetika zur Behandlung von chronischen Schmerzen. Doch ihr Einsatz führt auch zu ungewollten Nebeneffekten, die durch die Aktivierung von Opioidrezeptoren im Zentralen Nervensystem (ZNS) ausgelöst werden. Im Gegensatz dazu führt die Aktivierung von Opioidrezeptoren an peripheren sensorischen Neuronen durch endogene Opioidpeptide, die von Immunzellen im entzündeten Gewebe freigesetzt werden, zur Schmerzlinderung ohne ZNS ausgelöste Nebenwirkungen zu verursachen. Allerdings werden Opioidpeptide durch Peptidasen wie Aminopeptidase N (APN) und Neutrale Endopeptidase (NEP) abgebaut, was intensiv im Zentralen Nervensystem und an Immunzellen von gesunden Tieren und Menschen untersucht wurde. Unsere Hypothese ist, durch Inhibierung von APN und NEP den Abbau von Opioidpeptiden zu verhindern und den lokalen Entzündungsschmerz zu lindern. Dazu wurden Immunzellen und periphere Nerven als Quelle von APN und NEP und ihre Präferenz an der Degradation von Met-Enkephalin (MENK), Leu-Enkephalin (LENK), Dynorphin A (DYN) und Endorphin (END) untersucht. Als Entzündungsmodell wurde die Freund`s Complete Adjuvants-induzierte, lokale Entzündung einer Hinterpfote bei Ratten angewandt. Zur Inaktivierung der Peptidasen wurden selektive Inhibitoren Bestatin (APN) und Thiorphan (NEP), sowie der Duale-Inhibitor P8B eingesetzt. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie konnten APN und NEP in der aus lokaler Entzündung entnommenen Makrophagen und Granulozyten, aber nicht auf T-Lymphozyten, nachgewiesen werden. In vitro wurde die Aktivität von APN und NEP in Immunzellmembranen oder Nervengewebe-Suspensionen spektrophotometrisch anhand des Abbaus der spezifischen Substrate Ala-βNA und Suc-Ala-Ala-Phe-p-NA untersucht. Die Akkumulation der entsprechenden Metaboliten βNA und pNA konnte dosis-abhängig durch Bestatin und Thiorphan oder P8B verringert werden. Die Inkubation von Immunzellmembranen oder Nervengewebe-Suspensionen mit exogen zugegebenen MENK, LENK, DYN und END führt zu ihrem Abbau. In beiden Geweben konnte der Abbau der Enkephaline, nicht aber der von END, dosis-abhängig und vollständig durch Bestatin und Thiorphan oder P8B verhindert werden. Zusätzlich blockierten die Inhibitoren den Abbau von DYN in Nervengewebe- Suspensionen. In vivo resultierte die Injektion von Bestatin und Thiorphan in Kombination bzw. von P8B in die entzündete Pfote in einer erheblichen Verminderung der Hyperalgesie als Antwort auf einen schmerzhaften Druckreiz. Dieser analgetische Effekt, wurde vollständig durch die Gabe von spezifischen MENK-, LENK- und DYN-Antikörpern aufgehoben und von END-Antikörpern leicht abgeschwächt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass Enkephaline die bevorzugten Substrate von leukozytären und neuronalen APN und NEP in Entzündung sind. DYN erscheint als Substrat beider Enzyme in peripheren Nerven. Der unterdrückte Abbau von Opioidpeptiden durch die selektive Inhibition von APN und NEP vermindert Entzündungsschmerz ohne zentrale Nebenwirkungen.