Attachment of stearic acid to the Hemagglutinin-Esterase-Fusion (HEF) protein of influenza C virus affects membrane fusion and virus replication

Abstract

The only spike of Influenza C virus, the hemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein HEF combines receptor binding, receptor hydrolysis and membrane fusion activities. HEF is S-acylated, but in contrast to HA of Influenza A and B virus, it contains just one acylation site, a cysteine located at the cytosol-facing end of the transmembrane region which contains stearic acid. Previous studies established the essential role of Sacylation of HA for replication of Influenza A and B virus by affecting budding and/or membrane fusion, but the function of acylation of HEF was hitherto not investigated. Using reverse genetics we rescued a virus containing non-stearoylated HEF, which was stable during serial passage and showed no competitive fitness defect, but the growth rate of the mutant virus was reduced by one log. Acylation of HEF does neither affect the kinetics of its plasma membrane transport nor the protein composition of virus particles. Cryo-electron microscopy showed that the shape of viral particles and the hexagonal array of spikes typical for Influenza C virus were not influenced by this mutation indicating that virus budding was not disturbed. However, the extent and kinetics of hemolysis were reduced in mutant virus suggesting that non- acylated HEF has a defect in membrane fusion.

Esterase-Fusionsglycoprotein (HEF) besitztrezeptorbindende, rezeptorzerstörende und membranfusionierende Aktivität. Es vereint damit die Aktivitäten der beiden Membranproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) der Influenza A und B Viren. HEF ist kovalent mit Fettsäuren modifiziert, aber im Gegensatz zum HA besitzt es nur eine Acylierungsstelle, nämlich ein Cystein lokalisiert an dem Cytosolzugewandten Ende seiner Transmembranregion. Zudem wird HEF mit Stearinsäure, und nicht, wie die meisten anderen acylierten Proteine, mit Palmitinsäure modifiziert. Frühere Studien etablierten die essentielle Rolle der Acylierung des HA für die Replikation von Influenza A und B Viren, wobeientweder der Viruseintritt durch Membranfusion oder die Virusfreisetzung gestört war. Die Funktion der Acylierung von HEF wurde bisher noch nicht untersucht. Mit Hilfe der reversen Genetik habe ich ein rekombinantes Virus hergestellt, welches nicht-acyliertes HEF enthält. Die eingefügte Mutation ist stabil während einerseriellen Viruspassage und die mutierten Viren zeigten keinen Fitnessdefekt, aber die Wachstumsrate der mutierten Virenwar um etwa eine Zehnerpotenz gegenüber dem Wildtyp-Virus reduziert. Die Acylierung des HEF hat weder Einfluss auf die Kinetik seines Transportes zur Plasmamembran noch auf die Proteinzusammensetzung von Viruspartikeln. Kryo-Elektronenmikroskopie zeigte, dass die Morphologie der Viruspartikel und auch die für Influenza C Viren typische hexagonale Anordnung der Spikeproteine von der Mutation nicht beeinflusst wurden. Jedoch zeigten mutierte Viren eine reduzierte Hämolyseaktivität, was darauf hindeutet, dass der virale Zelleintritt mittels Membranfusion gestört ist.