Fibrogenese und Fibrolyse bei der Muskeldystrophie Typ Duchenne

Abstract

Die Muskeldystrophie Typ Duchenne ist die häufigste neuromuskuläre Erkrankung im Kindes- und Jugendalter. Sie wird X-chromosomal rezessiv vererbt und tritt bei 1:3500 neugeborenen Knaben auf. Der klinische Verlauf ist durch einen kontinuierlichen Verlust der willkürmotorischen Fähigkeiten und eine deutlich verkürzte Lebenserwartung gekennzeichnet. Ursache ist das Fehlen von Dystrophin aufgrund von Mutationen im DMD-Gen. Dystrophin ist ein subsarcolemmal gelegenes Protein, das eine zentrale Rolle für die Stabilität und die Funktionstüchtigkeit von Muskelfasern spielt. Zu Beginn der Erkrankung kommt es zu einer intensiven Degeneration und Regeneration von Muskelfasern und zu einer inflammatorischen Reaktion. Im Verlauf dominiert die Fibrose der quergestreiften Muskulatur („fibrogene Regeneration“). Der Vergleich zwischen verschiedenen Spezies mit einer dystrophinnegativen Muskeldystrophie ergibt, dass allein durch das Fehlen von Dystrophin weder der Phänotyp noch der histologische Befund erklärt werden kann. Bei der mild betroffenen mdx-Maus entwickelt sich erst spät eine Muskelfibrose, bei dem schwer betroffenen GRMD- Hund ist die Muskulatur frühzeitig fibrotisch degeneriert. Es müssen daher sekundäre Prozesse pathophysiologisch bedeutsam sein, die speziesabhängig unterschiedlich reguliert werden. Eine Organfibrose ist Ausdruck einer Störung zwischen Auf- und Abbau der extrazellulären Matrix (ECM). Als Komponenten der ECM wurden Kollagen I, III, IV, VI, XIV, Elastin, Tenaszin und Fibronektin immunhistochemisch untersucht. Es wurde reifes Bindegewebe mit einem erhöhten Anteil fibrillärer Kollagene I und III und einer vermehrten Expression von Proteinen wie Tenaszin, die in der Muskelentwicklung und Muskelregeneration eine Rolle spielen, nachgewiesen. Die basalmembranständigen Kollagene IV und VI waren entsprechend der vermehrten Regeneration hochreguliert. Die MMP (Matrix-Metalloproteinase)-1 und MMP-2 sind am Abbau und Umbau der ECM beteiligt, MMP-1 besonders in den Abbau fibrillärer Kollagene. Die Expression von MMP-1 und MMP-2 sowie von deren Inhibitoren TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase)-1 und TIMP-2 wurde auf Proteinebene immunhistochemisch und mittels Westernblot untersucht. Die mRNA Expression wurde mit der in situ- Hybridisierung lokalisiert und mit der RT-PCR quantifiziert. Es ergab sich ein einheitliches Muster mit einer Hochregulation von TIMP-1, TIMP-2 und MMP-2. Für MMP-2 wurde mit der Zymographie auch eine gesteigerte Enzymaktivität nachgewiesen. Von MMP-1 war trotz der stark vermehrten Synthese von ECM weder die mRNA noch das Protein vermehrt nachweisbar. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sprechen dafür, dass bei der DMD eine Hemmung der Fibrolyse vorliegt. Da bislang keine kurative Behandlungsmöglichkeit zur Verfügung steht, erscheint es sinnvoll antifibrotische Therapieansätze - wie z.B. den Einsatz von TGF-β1 Antagonisten - zu evaluieren.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most frequent neuromuscular disorder in children and adolescents. It is an X-linked recessive disorder with an incidence of one in 3,500 newborn boys. Progressive weakness results in loss of gait at the age of 10-12 years and life expectancy is limited to 20-25 years of age because of respiratory and/or cardiac failure. DMD is caused by mutations of the DMD-gene. The gene product is the subsarcolemmal protein dystrophin which is important for the stability and function of muscle fibres. Loss of dystrophin begins with marked muscle fibre degeneration and regeneration associated with inflammatory changes and an increase of endo- and perimysial extracellular matrix (ECM). This process results in a vast destruction of striated muscles and excessive deposition of connective tissue (“misdirected” or “fibrogenic” regeneration). The comparison between different species with dystrophin negative muscular dystrophy shows that loss of dystrophin alone does explain neither phenotype nor histological findings. The mildly affected mdx mouse shows remarkable muscle fibrosis only in a late stage of the disease. However, in the severely affected GRMD dog, muscle fibrosis already occurs during the first months of life. One may hypothesize that secondary pathophysiological changes are differentially regulated in various species. Organ fibrosis is the result of disequilibrium of fibrolysis und fibrogenesis. In this work, the ECM components collagen I, III, IV, VI, XIV, elastin, tenascin, and fibronectin were investigated by immunohistochemical staining. As a result, mature connective tissue with an increased content of fibrillary collagens and of proteins, which are involved in myogenesis and regeneration like tenascin, could be demonstrated. Basal membrane associated collagens IV and VI were found increased according to the degree of muscle fibre regeneration. Matrix metalloproteinases (MMP)-1 and MMP-2 are required for degeneration and remodelling of ECM. MMP-1 is especially involved in degeneration of fibrillary collagens. Expression of mRNA and of protein were investigated for MMP-1, MMP-2, and for the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)-1 and TIMP-2. Protein was shown by immunohistochemical staining and Westernblot. The mRNA expression was localized by in situ hybridisation and quantified by RT-PCR. There was a consistent pattern of up regulation of MMP-2, TIMP-1, and TIMP-2. However, in MMP-1 neither mRNA nor protein was increased in spite of a remarkable up regulation of ECM synthesis. These findings suggest that decreased fibrolysis in muscle contributes to the course of the disease in DMD. Because there is no curative therapy available, Studies on antifibrotic drugs like TGFβ-1 antagonist are warranted.