Mannose-Rezeptor vermittelter Gentransfer in humane Dendritische Zellen

Abstract

Rezeptor-vermittelter Gentransfer bietet die Möglichkeit eines zellspezifischen „Targetting“ in vitro und in vivo. Durch Kultivierung von CD34+Stammzellen oder CD14+ monozytären Vorläuferzellen in Gegenwart von Zytokinen ist es heutzutage möglich, eine große Anzahl an Dendritischen Zellen (DC) für die zelluläre Immuntherapie ex vivo zu generieren. Eine effektive Möglichkeit der Antigenbeladung von Antigen-präsentierenden Zellen stellt die Transfektion von Tumorantigen-kodierender DNA dar (Kombination multipler Epitope von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA), vornehmliche Präsentation über MHC-Klasse-I und Priming von CD4+ sowie CD8+ T-Zellen). Verschiedene Nachteile des viralen Gentransfers (Rekombinationsereignisse, insertionale Mutagenese bei Retroviren, fehlende Zelltypspezifität, Antikörper-vermittelte Inaktivierung in vivo) machen nicht-virale Methoden für klinische Anwendungen attraktiv (Transfektion ausdifferenzierter und teilungsunfähiger Zellen, episomale Plasmid-DNA mit großen Inserts). In der vorliegenden Arbeit wurde ein nicht-virales Rezeptor-vermitteltes In-vitro-Gentransfersystem für humane DC aus CD14+ monozytären Vorläuferzellen etabliert. Als Ziel-Rezeptor diente der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR), welcher auf unreifen DC stark exprimiert wird und eine starke endozytotische Aktivität aufweist. Neben Poly-L-Lysin (50kD) kam hierbei Polyethylenimin (50kD und 800kD) zum Einsatz. In Analogie zur Synthese von Neoglykoproteinen wurden die Polymere PL und PEI mit Mannose, dem als Ligand am besten geeigneten Monosaccharid, kovalent verbunden. Zur Etablierung und Optimierung der Transfektionsbedingungen wurde ein Modell-System mit Ratten-Fibroblasten-Zellen (MMR61), die den humanen MMR als Transgen exprimieren, etabliert. Über ein Luciferase-Expressionssystem erfolgte die Quantifizierung der Transfektions-Effizienz. Es konnte gezeigt werden, dass mannosyliertes PEI (800kD) hervorragend zur MMR-spezifischen Transfektion von MMR61-Zellen geeignet ist, wobei sich eine um einen Faktor 3 bessere Transfektions-Effizienz des mannosylierten gegenüber dem nativen Polymer zeigte. Die Zahl transfizierter MMR61-Zellen betrug dabei mindestens 13%. Eine Expressionsdauer von bis zu 1 Woche war mit M-PEI (800kD) nachweisbar, gegenüber nur 2-3 Tagen bei M-PL (50kD). Humane DC ließen sich prinzipiell mit M-PEI MMR-spezifisch transfizieren (4,5fach höhere Transgen- Expression mit M-PEI (800 kD) und 11fach höhere Transgen-Expression mit M-PEI (50kD) gegenüber dem nativen Polymer), wobei eine erhebliche interindividuelle Variabilität der Transfizierbarkeit von MoDC verschiedener Blutspender zu beobachten war. Hierbei zeigte sich eine Transfizierbarkeit von bis zu 26% der individuellen DC-Präparationen, dies jedoch bei erheblicher Toxizität der Transfektionskomplexe. Mögliche Ursache hierfür könnte das hohe degradative Potential des dem MMR nachgeordneten endozytotischen Pathways sein. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass der MMR eine Rezeptor- vermittelte Transfektion ermöglicht, speziell für DC ist diese Methode jedoch anderen etablierten Gentansfer-Systemen deutlich unterlegen. Die Eignung des vorgestellten Transfektionssystems zur In-Vivo-Transfektion von DC bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Receptor mediated gene transfer facilitates cell specific targeting in vitro and in vivo. The generation of sufficient numbers of Dendritic Cells (DC) for adaptive cellular therapy has been established by culturing CD34+ stem cells or CD14+ mononuclear cells in the presence of specific cytokines. Loading antigen presenting cells (APC) effectively can be accomplished by transfection with tumor antigen (TAA) coding DNA (combination of multiple tumor epitopes, presentation via MHC class I molecules and priming of CD8+ T cells). Potential risks with viral gene transfer (insertional mutagenisis, lack of cell specificity, antibody mediated inactivation) make non viral gene transfer methods an attractive alternative for potential clinical applications (transfection of differentiated non dividing cells, episomal plasmid DNA with long inserts).This work describes the establishment of a non viral receptor mediated in vitro gene transfer system for human dendritic cells. The target receptor is the human mannose receptor (MMR), that is highly expressed on immature DC and that has a strong endocytotic capacity. As DNA carrier Poly-L-lysine (50kD) and Polyethyleneimine (50kD and 800kD) were used. Neoglycopolymeres were synthesized by ligation with mannose that has the strongest affinity to the MMR among the monosaccharides. Transfections conditions were optimized using a rat fibroblast cell line stably expressing the human MMR (MMR61). Transfection efficiency was quantified using an luciferase expression plasmid as reporter gene. It could be shown that mannosylated PEI (800kD) was highly suitable for specific transfection of MMR61 cells. Luciferase expression values were 3 times higher with mannosylated PEI compared to native PEI. The percentage of transfected MMR61 cells was at least 13% with mannosylated polymer. Expression kinetics showed a durable transgene expression of up to 1 week with mannosylated PEI but lasted only 2-3 days with mannosylated Poly-L-lysine. Human primary DC could be specifically transfected with mannosylated PEI (800kD 4,5 times and 50kD 11 times higher) albeit with greatly varying efficiencies comparing different individual DC preparations. Up to 26% of all DC cultures could be transfected. A major limitation though was prominent cell toxicity of the transfection complex, depending possibly on the high degradative potential of the downstream endocytotic pathway. Summarizing this work shows the feasibility of a MMR dependent non viral gene transfer. In comparison to other transfection methods, particularly viral gene transfer, the efficiency is inferior for primary DC transfection. The suitability of the established method for in vivo transfection of DC remains to be analyzed.