Physikalische Kartierung und Genomische Struktur des Kariopherin Alpha 2 Gens: Untersuchungen zu Heterozygotieverlusten in der chromosomalen Region 17q23 und zum allgemeinen Mikrosatellitenstatus an mikrodisseziierten kolorektalen und Mammakarzinomen beim Menschen

Abstract

Ziel der Untersuchungen war es, mit Hilfe verschiedener Methoden der physikalischen Kartierung das Kariopherin Alpha 2 Gen zu lokalisieren und durch Sequenzanalysen dessen genomische Struktur zu identifizieren. Weiterhin sollten kolorektale und Mammakarzinome mit Mikrosatellitenmarkern aus der Region 17q23 und aus anderen, in Tumoren häufig veränderten, chromosomalen Regionen auf das Vorliegen von Heterozygotieverlusten untersucht werden. Unter Verwendung einer Reihe somatischer Zellhybride wurde das KPNA2-Gen auf dem Chromosom 17 lokalisiert. Eine weitere Eingrenzung der Position auf den distalen Abschnitt des langen Armes des Chromosoms (17q23) erfolgte mit Hilfe einer YAC-Bibliothek und fünf Zellhybriden mit chromosomalen Fragmenten aus der Region 17q. Die Sequenzierung von klonierten DNA-Fragmenten und die Untersuchung der genomischen Struktur des KPNA2-Gens ergab, daß das Gen aus 11 Exons besteht und ohne den Promotor eine Größe von ca. 11000 bp besitzt. Besonders auffällig ist, daß sich in den Introns 5, 7 und 9 repetitive Sequenzen (sogenannte ALU- Wiederholungen) befinden, die das Gen für interne Deletionen und Duplikationen anfällig machen. Die Untersuchungen zu Heterozygotieverlusten erfolgte mit Hilfe der PCR- Technik an mikrodisseziierten Tumoren. Es wurden 40 kolorektale Karzinome mit 12 Mikrosatelliten-markern und 30 Mammakarzinome mit 7 Mikrosatellitenmarkern getestet. Die Kolonkarzinome zeigten für die Region, die durch die Marker D17S1813 und D17S1870 definiert wird und unmittelbar an das KPNA2-Gen grenzt, eine, im Vergleich zu anderen auf dem Chromosom 17 befindlichen Markern, relativ hohe Verlustrate. Die durchschnittliche LOH-Frequenz der Mikrosatellitenmarker auf anderen Chromosomen lag im Vergleich zu der auf 17q befindlichen Marker um ca. 17 % höher. Die untersuchten Mammakarzinome wiesen in der Region, in der sich die Marker D17S1813, D17S1870 und D17S789 befinden, die größte LOH-Zahl auf, wobei das Verlustbild insgesamt gleichmäßiger erscheint. Dies könnte darauf hindeuten, daß es sich bei den deletierten Abschnitten um größere Teilbereiche des Chromosoms handelt. Im Gegensatz dazu läßt sich bei den Kolonkarzinomen vermuten, daß sich in der relativ kleinen Region mit der größten LOH-Rate ein Gen befindet, welches an der Tumorentstehung und -entwicklung beteiligt sein kann. Da sich das KPNA2-Gen in unmittelbarer Nähe zu diesem Locus befindet, wäre es durchaus denkbar, daß es sich dabei um ein Kandidatengen handelt.

The aim of the investigations was to localize the Karyopherin Alpha 2 Gene by using various methods of physical mapping and to identify it´s gene structure by means of sequence analysis. Furthermore colorectal and mammary carcinomas with microsatellite markers from the region 17q23 as well as from other regions, which often show changes in tumors, were examined for the existence of heterozygosity loss. By using several somatic cell hybrids we localized the KPNA2-Gene on the chromosome 17. Due to the support of the YAC-library and five cell hybrids with chromosomal fragments, derived from the region 17q, it was possible to achieve a more specific determination of the position on the long arm of the chromosome (17q23). The sequencing of cloned DNA fragments and the examination of the genomic structure of the KPNA2-Gene yielded that the gene consists of 11 exons and has the size of 11000 base pairs, not considering the promotor. It is very conspicious that there are repetitive sequences in the introns 5, 7 and 9 (so called ALU- repetitions), that make the gene susceptible to internal deletions and duplications. The investigations on the loss of heterozygosity took place by using the PCR- technique in microdissected tumors. We tested 40 colorectal carcinomas with 12 microsatellite markers and 30 mammary carcinomas with 7 microsatellite markers. The colorectal carcinomas revealed for the regions, that are defined by the markers D17S1813 and D17S1870 and directly border on the KPNA2-Gene, a relatively high rate of loss in comparison to other markers localized on the chromosome 17. The everage LOH-frequency of microsatellite markers that are localized on other chromosomes showed to be approximately by 17 % higher than that of markers on 17q. The examined mammary carcinomas in the region, that contained the regions D17S1813, D17S789 and D17S1870, had the highest LOH- figure, mentioning that the image of loss in total appears more steady.