Untersuchungen des Expressionsprofils der Cyclin-abhängigen Cyclinkinase- Inhibitoren p21 CIP1/WAF1 und p27 KIP1 in spontanen Mammatumoren beim Hund

Abstract

Im Rahmen der Karzinogenese von epithelialen Tumoren kommt dem Zellzyklus und dessen Kontrolle entscheidende Bedeutung zu. Die verschiedenen Regulatoren sind verantwortlich für den kontrollierten Ablauf des Zellzyklus, aus dem letztlich eine fehlerfreie Verdoppelung der DNA resultieren soll. Humanmedizinische Forschungsarbeiten belegen die besondere Bedeutung des Expressionsprofils der Cyclin-abhängigen Cyclinkinase-Inhibitoren (CKIs) p21 und p27 im Rahmen der Karzinogenese von humanen Mammatumoren. Diese beiden CKIs wurden in veterinärmedizinischen Studien bei Caniden bislang nur unzureichend und vorwiegend auf Proteinebene untersucht. Ziel dieser Arbeit war es somit, einen Einblick in die Expressionsprofile von p21 und p27 auf molekularer Ebene sowie auf Proteinebene zu erhalten. Vor den quantitativen Untersuchungen von p21 und p27 in caninen Mammatumoren sollte zunächst die bei humanen Mammatumoren beschriebene Regulation der beiden CKIs auch bei der Spezies Hund bestätigt werden. Aus diesem Grund wurde zur Bestimmung differentieller Genexpression eine Affymetrixchip-Analyse an Proben von Mammakarzinomen der Spezies Hund (einfache, solide Karzinome) durchgeführt. Die Ergebnisse der Analyse zeigten eine Überexpression für p21 und eine verminderte Expression für p27 in den untersuchten Mammakarzinomen im Vergleich zu neoplastisch unverändertem Mammagewebe des gleichen Individuums. Die Veränderungen des Expressionsprofils von p21 und p27 ließen auf eine möglicherweise bedeutende Rolle dieser beiden CKIs auch im Rahmen der Karzinogenese caniner Mammatumoren schließen. Zur Validierung dieser Ergebnisse wurden im Anschluss an die Affymetrixchip-Analyse 25 Proben caniner Mammakarzinome und korrespondierende Proben von neoplastisch unverändertem Mammagewebe des gleichen Individuums intra operationem entnommen, histologisch klassifiziert und mittels real-time PCR quantitativ analysiert. p21 zeigte im Mittel eine 1,38-fache Expression in den untersuchten Mammakarzinomen im Vergleich zum korrespondierenden neoplastisch unveränderten Mammagewebe, was bedeutet, dass keine zuverlässige Aussage über eine Genregulation möglich ist. Für p27 lag die relative Expression in den Mammatumoren im Mittel beim 0,77-fachen der Expression, die im korrespondierenden neoplastisch unveränderten Mammagewebe des gleichen Individuums ermittelt wurde. Somit ist für beide Cyclin-abhängigen Cyclinkinase-Inhibitoren keine zuverlässige Aussage bezüglich einer Genregulation auf Transkriptionsebene möglich. Es zeigen sich hierfür allenfalls Tendenzen. Für p21 liegt tendenziell eine erhöhte und für p27 eine verminderte Genexpression in caninen Mammakarzinomen im Vergleich zu neoplastisch unverändertem Mammagewebe des gleichen Individuums vor. Im Anschluss an die Untersuchungen auf Transkriptionsebene wurde repräsentativ ein immunhistologischer Nachweis der beiden Kandidatengene durchgeführt, um eine semiquantitative Beurteilung der exprimierten p21- und p27-Proteinmengen zu ermöglichen. Für p21 zeigte sich im Tumorgewebe semiquantitativ eine deutlich erhöhte Proteinmenge im Vergleich zu neoplastisch unverändertem Mammagewebe, im Falle von p27 hingegen lag eine geringere Proteinexpression in den Mammatumoren im Vergleich zum korrespondierenden neoplastisch unveränderten Mammagewebe vor. Die Ergebnisse der Untersuchungen auf Proteinebene und Transkriptionsebene zeigen somit erhebliche Differenzen. Diese deuten auf eine mögliche posttranskriptionelle Regulation der beiden Cyclin-abhängigen Cyclinkinase-Inhibitoren hin. Sollten sich die semiquantitativen Ergebnisse der Untersuchungen auf Proteinebene auch durch quantitative Untersuchungen bestätigen lassen, existieren mit hoher Wahrscheinlichkeit posttranskriptionelle Mechanismen, die zur Regulation der Proteinexpression von p21 und p27 beitragen, die in Folgestudien genauer zu untersuchen wären.

The cell cycle and its mechanisms of control play an important role concerning the carcinogenesis of epithelial neoplasia. The different regulators of the cell cycle are responsible for its proper progress to assure the accurate doubling of the DNA. These issues in human research document the importance of the expression profile of the cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) p21 and p27 concerning the carcinogenesis of human mammary tumors. To date the investigation of these two CKIs has been insufficiently in veterinary research and was mainly focused on the protein expression of the two candidates. The goal of this study was to provide insight in the expression profile of p21 and p27. Mammary carcinomas (simple, solid carcinomas) were investigated in microarray analysis. The results revealed overexpression of p21 and a limited expression of p27 in canine mammary tumors compared with non-neoplastic mamma of the same individual. 25 canine mammary carcinomas and corresponding non- neoplastic mammary tissue of the same individual were taken intra operationem, followed by histological classification of tumor species and their quantitative analysis of transcriptional expression concerning p21 and p27. p21 showed an 1,38-fold higher expression level in canine mammary tumors as in non-neoplastic mammary tissue of the same dog what means that a reliable predication of gene-regulation is impossible. The expression level for p27 was 0,77-fold in the carcinomas compared to non-neoplastic mammary tissue of the same dog. Both cyclin-dependent kinase inhibitors did not show regulation in expression concerning their transcription. Only tendential regulation was obvious. p21 showed the tendency for a higher, p27 for a lower gene-expression in the mammary carcinomas compared to non-neoplastic mammary tissue of the same dog. The expression-analysis at transcriptional level of the two candidates was followed by the randomized immunohistochemical analysis of their protein expression to provide semiquantitative information about the protein expression of p21 and p27. Immunohistochemical staining concerning p21 indicated a higher expression level of this protein in canine carcinomas whereas for p27 the staining of p27- protein was limited in canine carcinomas compared to non-neoplastic mammary tissue of the same individual. Thus the results of immunhistochemical investigation and the protein expression of the two candidates differ from expression at the transcriptional level (mRNA expression) shown by real-time PCR. The results indicate a possible posttranscriptional regulation of these two CKIs. If it is possible to approve the semiquantitative investigation of the protein level also in quantitative investigations posttranscriptional pathways are likely contributing in the regulation of p21 and p27 protein expression and should be investigated in further studies properly.