From molecules to tissue: Fluorescence spectroscopy and microscopy of nanoparticles and biomolecules involved in inflammation and pain

Abstract

The focus of this thesis is on the application of time-resolved fluorescence methods, fluorescence anisotropy and state-of-the-art fluorescence microscopy, such as single-molecule microscopy and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), to gain new insights into the molecular properties of nanoparticles and their interaction with tissue in the context of inflammation and pain. Single-molecule microscopy was applied to determine the morphology and the internal structure of nanostructured lipid carriers (NLC). To visualize the morphology an affinity labeling procedure was developed, employing principals of localized stochastic reconstruction microscopy to generate super-resolution images of NLC structures below the Abbe diffraction limit. Visualization of the internal structure of NLCs was achieved by single particle tracking of fluorescent drug mimetics. It could be shown for the first time that the analyzed NLCs consist of a fluid core in a solid lipid shell. Thus, the single-molecule microscopy methodology established here allows the direct visualization of NLC structures, enabling the correlation between NLC composition and the NLC structure required to generate tailor-made NLCs. Knowledge of the physicochemical properties of nanoparticles is of paramount importance for their nanomedical application. In this work, fluorescence lifetime and time-resolved fluorescence anisotropy were used to investigate the influence of the environment and temperature on the structure and dynamics of two polymer particles (dendritic polyglycerol sulfate (dPGS) and core-multishell (CMS) nanoparticles). Structural changes within the physiological temperature range were detected, which influence either particle size or the internal distribution of drug mimetics, both of which can directly affect therapeutic efficacy. Imaging techniques allow for the localization of nanoparticles in tissue. Confocal raster scanning microscopy in combination with FLIM measures the fluorescence lifetime decay curve of excited fluorescent molecules in every image pixel. Therefore FLIM has an increased contrast compared to conventional fluorescence microscopy. A major challenge in FLIM data analysis is the poor signal-to-noise ratio of the fluorescence lifetime curves recorded in each pixel which complicate the determination of fluorescence lifetimes, particularly if a specific fluorescence lifetime signature, e.g. of a fluorescently labeled nanoparticle, is to be detected against the autofluorescent background of tissue samples. Ratiometric FLIM analysis, which uses the specific amplitude ratio of the fluorescence lifetimes, enabled the detection of the specific binding of an opioid to its membrane receptor as well as the localization of dPGS in liver tissue. Since the ratiometric method reaches its limits at low photon count rates and when the fluorescence lifetime decay curves contains more than two decay components, a multivariate analysis method was developed in the group of Prof. Alexiev, and applied in this thesis to study the skin penetration and localization of CMS and silica nanoparticles as well as fluorescently labeled biomolecules.

Der Schwerpunkt dieser Doktorarbeit lag auf der Anwendung und Etablierung neuer analytische und bildgebende Verfahren um Informationen über molekulare Eigenschaften von Nanopartikeln und ihrer Interaktion mit Gewebe im Kontext von Schmerz- und Entzündungsprozessen zu erhalten. Insbesondere wurden Techniken der zeitaufgelösten Fluoreszenz, Fluoreszenzdepolarisation und state-of-the-art Fluoreszenzmikroskopiemethoden, wie Einzelmolekül- Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzlebensdauerimagingmikroskopie (FLIM) angewandt. Basierend auf Methoden der Einzelmolekülmikroskopie konnten die Morphologie und die innere Struktur von NLC bestimmt werden. Zur Visualisierung der Morphologie wurde eine Affinitätslabeling-Strategie entwickelt, die mittels stochastischer Bildrekonstruktion Superresolution-Images der NLC-Strukturen unterhalb des Abbe'schen Beugungslimits ermöglichte. Die internen Strukturen von NLCs wurden mittels Einzel-Partikel-Verfolgung von fluoreszierenden Wirkstoff-Mimetika sichtbar gemacht. Es konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass die untersuchten NLCs einen fluiden Kern in einer festen Lipidschale haben. Die hier etablierte Methodik der Einzelmolekülmikroskopie erlaubt es somit, direkt die NLC Strukturen sichtbar zu machen. Damit ist eine Korrelation der Struktur und der Zusammensetzung der NLC Komponenten möglich, die für ein zielgerichtetes NLC Design unerlässlich ist. Die Kenntniss der physikochemischen Eigenschaften von Nanopartikeln ist für ihre Anwendung in der Nanomedizin von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wurde anhand der Fluoreszenzlebensdauer und der zeitaufgelösten Fluoreszenzanisotropie der Einfluss der Umgebung und der Temperatur auf die Struktur und Dynamik von zwei Polymerpartikeln (dendritisches Polyglycerolsulfat (dPGS) und Core-Multishell (CMS) Nanopartikel) untersucht. Es konnten Änderungen im physiologischen Temperaturbereich festgestellt werden, die entweder Auswirkungen auf die Größe der Partikel oder auf die Verteilung von Wirkstoff-Mimetika im Inneren des Partikel hatten. Beides kann direkt die therapeutische Wirksamkeit beeinflussen. Bildgebende Verfahren erlauben die Lokalisation von Nanopartikeln im Gewebe. Konfokale Rastermikroskopie in Kombination mit FLIM basiert auf der Messung der Fluoreszenzlebensdauer von angeregten fluoreszierenden Molekülen in jedem Bildpixel. Damit hat FLIM gegenüber der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie einen erhöhten Kontrast. Eine Herausforderung für die Datenanalyse ist jedoch das schlechte Signal-Rausch- Verhältnis der pixelbasierten Fluoreszenzlebensdauerkurven, die eine Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern komplizieren, speziell wenn eine spezifische Fluoreszenzlebensdauer-Signatur, z.B. eines fluoreszenzmarkierten Nanopartikels, im autofluoreszierenden Gewebe detektiert werden soll. Mit Hilfe einer ratiometrischen FLIM Analyse, die das spezifische Amplitudenverhältnis der Fluoreszenzlebensdauern nutzt, konnte sowohl die spezifische Bindung eines Opioids an seinen Membranrezeptor als auch die Lokalisation von dPGS im Lebergewebe gezeigt werden.